Poly(A)結合タンパク質PABPによる翻訳制御機構の解明

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07J02032
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 今井 駿輔 The University of Tokyo, 大学院・薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Keywords: 翻訳制御 / mRNA / Poly(A)結合タンパク質 / NMR

Research Abstract

今年度は、両領域の相互作用をNMR法を用いて構造生物学的に解明することを目指して解析を行った。まず、RRM12(残基番号1-190)とLt2(残基番号421-470)の主鎖NMRシグナルの帰属を行った。次に、両者の相互作用解析を滴定実験によって解析した。その結果、Lt2の滴定によって化学シフト変化が生じるRRM12の残基は、poly(A)結合領域の反対側に多く存在すること、RRM12との相互作用によって化学シフト変化が生じるLt2の残基は、W437を中心とした領域に集中していることが明らかとなった。しかしながら、滴定実験から見積もられる両者の相互作用の解離定数がおよそ10^<-5>Mの程度と弱いこと、Lt2のシグナルが全体的に化学シフト変化したことから、RRM領域全体とリンカー領域全体を用いた解析が必要であることが示唆された。
そこで、全てのRRMを含むコンストラクトRRM1234(残基番号1-370)と、リンカー領域全体を含むコンストラクト(残基番号371-543)を用いてNMR解析をすることとした。しかしながら、RRM1234に関してはこれまでに発現・精製系を確立していたものの、リンカーに関しては大腸菌での発現中に非特異的な切断を受けることが分かっており、新たな発現系の確立が必要であった。そこで、ketosteroid isomerase(KSI)との融合体としての大腸菌発現を試みた。その結果、KSIと融合したリンカーは分解を受けることなく大量に発現し、これを7Mの尿素で可溶化した後に高純度に精製することができた。こうして精製したRRM1234とリンカーはpoly(A)依存的に相互作用した。今後はRRM1234上に常磁性スピンを導入し、リンカーがRRM1234と相互作用した際に受ける常磁性緩和促進効果を単独状態のリンカーのNMRシグナル強度の減少として観測することで、両者の複合体モデルを構築することを目指す。