2007 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム複製開始点の2重鎖DNAを特異的に開裂する蛋白質高次複合体のメカニズム
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07J03615
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
尾崎 省吾 Kyushu University, 薬学研究院, 特別研究員(DC2)
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| Keywords | ゲノム複製 / タンパク質-DNA高次複合体 / DNA2重鎖開裂 / 複製開始点 / 蛋白質構造変化 / AAA+蛋白質 / 変異体解析 / 構造-活性相関 |
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| Research Abstract |
ゲノム複製のためには、イニシエーターが複製開始点で複合体を形成した後、開始点の2重鎖DNAを開裂しなければならない。この2重鎖DNA開裂反応にはAAA+ファミリー蛋白質が重要な役害を担っている。大腸菌のゲノム複製開始反応では、AAA+ファミリー蛋白質DnaAが複製開始点oriC上で動的な高次複合体を形成し、ATP結合に依存して2重鎖DNAの開裂を促す。研究代表者はAAA+蛋白質の構造特性と超好熱菌由来の精製DnaA蛋白質(tmaDnaA)の結晶構造解析に基づき、「DnaAによるリング様多量体の形成とリング中央の孔(ポア)の内側に露出したアミノ酸残基によるoriC開裂反応の促進」というモデルを提唱している。このモデルの検証のために、本計画研究ではモデル蛋白質であるtmaDnaAにより形成される蛋白質高次複合体の機能構造を解析し、AAA+蛋白質が触媒する2重鎖DNA開裂の普遍分子機構を理解することを目指した。
(1)DnaAリング様複合体形成のための蛋白質間相互作用様式の解明
構造解析と生化学的解析によりtmaDnaA蛋白質が形成する蛋白質高次複合体の機能構造の解明を進め、論文発表した(JBC,2008)。DNase Iフットプリント実験を用いて、DNA上でのtmaDnaA多量体形成様式を解析する方法を構築した。この方法によりATP結合に依存したtmaDnaA複合体の構造変化を検出することに成功した。
(2)2重鎖開裂により生じた1本鎖DNAとDnaAポア領域との相互作用様式の解明
ゲルシフト実験を用いて、1本鎖化DNAとtmaDnaA蛋白質との結合を評価する方法を構築した。変異体解析により、1本鎖化DNAとの結合能を特異的に欠損したtmaDnaA変異体を複数見いだした。これらの変異導入アミノ酸のいくつかは、DnaAポア領域に位置していた(JBC,2008;投稿準備中)。
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[Presentation]2008
Author(s)
尾崎省吾, 他
Organizer
第19回DNA複製・分配ワークショップ
Place of Presentation
静岡県伊豆市
Year and Date
20080304-07
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