2007 Fiscal Year Annual Research Report
Project/Area Number |
07J04702
|
Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
長門石 曉 The University of Tokyo, 大学院・新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC2)
|
Keywords | 蛋白質-DNA間相互作用 / 四本鎖DNA / 熱力学的解析 / 水和水 / トロンビン蛋白質 |
Research Abstract |
蛋白質によるDNAの四本鎖構造形成における基礎実験として、本研究員はthrombin蛋白質とDNAアプタマー(TBA)を用いて、金属カチオン非存在下においてthrombinがTBAを四本鎖構造へ誘起させることを円偏光二色性(CD)スペクトル測定によって朋らかにした(Biochem.Biophys.Res.Cozzmun.,352,812、(2007))。Thrombinによって形成された四本鎖DNAのCDスペクトルは、金属イオン(K^+)による四本鎖形成によって得られたCDスペクトルと比較して、290-300nm付近の正のバンド位置が異なることが分かった。thrombinによって形成されるDNA四本鎖構造は、そのG-quartet構造が、金属イオンによって形成されるG-qurtet構造と異なることが示唆された。 ThrombinとTBA間の相互作用に関して、熱量測定などによる詳細な解析を行うために、thrombin前駆体からのthrombinの大量作製を試みた。pET26ベクターを用いて、大腸菌(Rosetta2)による前駆体prethrombin-2の大量発現を行ったところ、蛋白質は封入体として得られることが分かった。グアニジン塩酸塩による可溶化を行い、L一アルギニン塩酸塩を用いた段階透析法によるリフォールディング操作を行った。しかし、得られた可溶性蛋白質はジスルフィド結合による多量体を形成することが分かり、大腸菌による大量のthrombin作製は困難であることが分かった。 そこで、動物細胞を用いた前駆体prothrombinの発現を試みた。pSRαベクターを用いてCOS7細胞をOpti-MEM培地にてトランスフェクションし発現を行った。その結果prothrombinが培地上清において分泌された。これら培地を回収し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、Ecarin酵素処理、さらにheparinカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、高純度のthrombinを得ることができた。現在、培地量を増やして大量発現を行っており、得られたthrombinを用いて等温滴定型熱量(ITC)測定を行う予定である。
|
Research Products
(6 results)