大腸菌Ada蛋白質-DNA複合体の立体構造解析と認識機構

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08260206
• Research Institution: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 大久保 忠恭 北陸先端科学技術大学院大学, 新素材センター, 助教授 (90272997)
• Keywords: NMR / 転写制御 / Ada蛋白質

Research Abstract

大腸菌のDNA修復蛋白質Adaの分子量16kDaのN末側機能ドメイン(N-ada16k)のDNA認識機構と修復系の活性発現と制御の仕組みについて、Ada蛋白質-DNA複合体のNMR解析により研究を行った。N-ada16kの遺伝子を大腸菌に組み込んだ大量発現系を構築した。培養及び精製条件を検討し、M9最小培地で収量20mg/Lの系を構築した。N-ada16kはCys69がメチル化されると転写制御因子として働くので、反応条件の検討によりCys69が選択的にメチル化されたme-C69 N-ada16kを調整した。この系を用いて蛋白質を^<13>C,^<15>N安定同位体ラベルしNMRシグナルの帰属と2次構造の同定を行ないN-ada16kとme-C69 N-ada16kの^<15>N-^1H HMQC及び^<113>CdNMRスペクトルを比較した。さらに、両者とDNAの複合体の^<15>N-^1H HMQCスペクトルの解析を行なった。DNAとの複合体形成によりDNA結合に関与する残基のNMRシグナルが線幅増大により観測されなくなった。この結果よりN-ada16kはHTH-DNA結合モチーフの領域でのみDNAと非特異的結合をしていることが明らかとなった。me-C69 N-ada16kではHTH-DNA結合モチーフの領域とCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと特異的結合をしていることが明らかとなった。変異体の結果は、HTH-DNA結合モチーフの領域がDNA認識に直接関与していることを示していた。即ち、メチル化により新たにCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと相互作用することにより、me-C69 N-ada16kは特定のDNA配列を確認することが可能となると考えられた。現在、この相互作用の詳細を明らかにするためにme-C69 N-ada16kとDNAの複合体の立体構造解析を行っている。

Research Products

• [Publications] H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letter. 323. 252-256 (1993)
• [Publications] T.Ohkubo: "Methylation dependent functional switch mechanism newly found in the Escherichia coli Ada protein" J.Am.Chem.Soc.116. 6035-6036 (1994)
• [Publications] H.Sakashita: "Methylation dependent functional switch mechanism of the Escherichia coli Ada protein" Proc.Japan Acad.71. 198-201 (1995)
• [Publications] H.Sakashita: "Sequence-specific DNA recognition of the Escherichia coli Ada protein associated with the methylation-dependent functional switch for transcriptional regulation" J.Biochem.118. 1184-1191 (1995)
• [Publications] 大久保忠恭: "Ada蛋白質の構造と機能" 核酸化学の新展開:蛋白質核酸酵素別冊. 40. 438-444 (1995)
• [Publications] E.H.Morita: "Implications of the zinc-finger motif found in the DNA-binding domain of the human XPA protein" Genes to Cells. 1. 437-442 (1996)