1998 Fiscal Year Annual Research Report
メチロトローフ酵母の細胞機能を利用した生体触媒系の構築と分子基盤
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08456051
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| Research Institution | KYOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
加藤 暢夫 京都大学, 農学研究科, 教授 (50026556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
由里本 博也 京都大学, 農学研究科, 助手 (00283648)
阪井 康能 京都大学, 農学研究科, 助教授 (60202082)
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| Keywords | メチロトローフ酵母 / Candida boidinii / 異種遺伝子発現系 / ペルオキシソーム / アルコールオキシダーゼ / ジヒドロキシアセトンシンターゼ / D-アミノ酸オキシダーゼ / プロモーター |
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| Research Abstract |
メタノール資化性酵母Candida boidiniiを用いて、オキシダーゼ発現宿主の創製と抗生物質生産株の育種を行った。
1) 異種遺伝子発現系に適用する新たなプロモーターの構築
C.boidiniiのジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DAS1)をクローニングし、その遺伝子破壊株を用いて、当該酵素がメタノール代謝に必須であることを明確にした。DAS1プロモーターを用いる発現系では、メタノールなどのC_1化合物によって顕著な誘導が、グルコースによっては誘導抑制が起こることを認めた。このDAS1プロモーターの挙動は、アルコールオキシダーゼ遺伝子(AOD1)プロモーターに類似していた。また、酵母PHO5をレポーター遺伝子として比較したところ、DAS1プロモーターは、AOD1プロモーターに匹敵する発現力を有することがわかった。
2) DAS1プロモーターを用いる発現系の構築
アルコールオキシダーゼ破壊株を宿主とし、DAS1プロモーターを組み込んだ発現ベクターを構築した。この異種遺伝子発現系では、添加したメタノールは消費されずに常に誘導基質として作用し、しかもアルコールオキシダーゼが占めるベルオキシソームの空間が発現する異種タンパク質のために保証されることから、ベルオキシソームに存在する各種のオキシダーゼ類の発現として有効であることが示された。
3) D-アミノ酸オキシダーゼを用いる物質生産系の構築
C.boidiniiのD-アミノ酸オキシダーゼをクローニングし、そのベルオキシソームへのソーティングと局在性を明らかにするとともに、セファロスポリンCの合成に有効なTrigonopsis variabilisのD-アミノ酸オキシダーゼをクローニングし、C.boidiniiでの大量発現を試みた。
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[Publications] Y.Sakai: "Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multi carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii" Yeast. 14. 1175-1187 (1998)
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[Publications] Y.Sakai: "Regulation and physiological role of the DAS1 gene, encoding dihydroxyacetone synthase, in the methylotrophic yeast Candida boidinii" J.Bacteriol.180・22. 5885-5890 (1998)
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[Publications] Y.Sakai: "Hemiacetal dehydrogenation activity of alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cereviciae" Biosci.Biotech.Biochem.62・10. 1956-1961 (1998)
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[Publications] Y.Sakai: "Subcellular localization of fructosyl amino acid oxidases in peroxisomes of Aspergillus terreus and Penicillium janthinellum" J.Biosci.Bioeng.87・1. 108-111 (1999)
