1996 Fiscal Year Annual Research Report

有機化学的アプローチによる酵素触媒反応機構の基礎的研究

Research Project

Project/Area Number	08456060
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	小田順一京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中啄治京都大学, 化学研究所, 助手 (40227145) 加藤博章京都大学, 化学研究所, 助手 (90204487) 平竹潤京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075)
Keywords	有機合成化学 / タンパク質工学 / 酵素反応機構 / X線結晶構造解析 / 遷移状態アナログ / グルタチオン / 立体特異性 / 分子認識
Research Abstract	本研究の目的は、タンパク質結晶学、遺伝子工学の手法を有機合成化学的なアプローチと組み合わせることで、酵素の反応加速の仕組みを立体構造に基づいて明らかにすることにある。そこで、ATPを補酵素として用いる反応として、異なる基質間にCN結合を形成するリガーゼを、また、NADPHを用いる反応として、トロピノンから互いにジアステレオマ-の関係にあるトロピンとψトロピンを生じる2つのトロピノン還元酵素を取り上げ、X線結晶解析による立体構造を基に、部位特異的変異導入と有機合成化学的なアプローチによって反応機構を明らかにしようとした。本年度得られた結果は以下の通りである。 (1)γグルタミルシステイン合成酵素の結晶化分子表面に存在するシステイン4残基(106、164、205、223)を部位特異変異導入法によりSer残基に置換した変異型酵素を調製することにより、ギ酸ナトリウムを沈殿剤として約0.2×0.2×0.1mmの直方体の単結晶を得ることに成功した。 (2)トロピノン還元酵素のX線結晶解析反応の立体特異性が異なる2つのトロピノン還元酵素、TR-IとTR-IIを重原子多重同形置換法を用いることにより、X線結晶構造解析を行い、三次元構造を求めた。 (3)グルタチオン合成酵素の活性中心に存在するArg225の役割の解析 Arg225をLysに変えた変異型酵素R225Kを用いて、遷移状態アナログに対する挙動を調べるとともに、R225Kと遷移状態アナログ複合体のX線結晶構造解析を行い、Arg225の役割を調べた。 (4)γグルタミルシステイン合成酵素の遷移状態アナログの合成 γグルタミルシステイン合成酵素の基質システインがアシルリン酸中間体を攻撃し、ペプチド結合が形成される段階の遷移状態を推定し、そのアナログとなる四面体型構造を持ったホスフィネート1とスルフォキシミン2を合成し、阻害機構を調べた。

Research Products

(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] Takane Hara,: "A Pseudo-Michaelis Quatemary Complex in the Reverse Reaction of Ligase : Structure of Escherichia coli B Glutathione Synthetase Complexed with ADP, Glutathione and Sulfate at 2.0-Å Resolution" Biochemistry. 35. 11967-11974 (1996)
[Publications] Toru Nakatsu: "Crystallization and Preliminary Crystallographic Study of Aspargine Synthetase from Escherichia coli B" Acta Crtstallogy.D. 52. 604-606 (1996)
[Publications] Takao Hibi: "Structure of the multifunctional loops in the nonclassical ATP-binding fold of glutathione synthetase" Nature Struct.Biol. 3. 16-18 (1996)
[Publications] 加藤博章: "有機化学とタンパク質結晶学-遷移状態アナログを用いて酵素反応機構を探る-" 日本結晶学会誌. 38. 99-104 (1996)
[Publications] Makoto Katoh: "Mechanism-Based Inactivation of E.coli γ-Glutamylcysteine Synthetase by Phosphinic Acid-and Sulfoximine-Based Transition-State Analogues." Bioorg.& Med.Chem.Lett.6. 1437-1442 (1996)
[Publications] Jun Hiratake: "Aminophosphonic and Aminoboronic Acids As a Key Element of Transition-State Analogue Inhibitor of Enzymes" Biosci.Biotech.Biochem.61. 211-218 (1997)

1996 Fiscal Year Annual Research Report

有機化学的アプローチによる酵素触媒反応機構の基礎的研究

Principal Investigator

小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)

Research Products

[Publications] Takane Hara,: "A Pseudo-Michaelis Quatemary Complex in the Reverse Reaction of Ligase : Structure of Escherichia coli B Glutathione Synthetase Complexed with ADP, Glutathione and Sulfate at 2.0-Å Resolution" Biochemistry. 35. 11967-11974 (1996)

[Publications] Toru Nakatsu: "Crystallization and Preliminary Crystallographic Study of Aspargine Synthetase from Escherichia coli B" Acta Crtstallogy.D. 52. 604-606 (1996)

[Publications] Takao Hibi: "Structure of the multifunctional loops in the nonclassical ATP-binding fold of glutathione synthetase" Nature Struct.Biol. 3. 16-18 (1996)

[Publications] 加藤博章: "有機化学とタンパク質結晶学-遷移状態アナログを用いて酵素反応機構を探る-" 日本結晶学会誌. 38. 99-104 (1996)

[Publications] Makoto Katoh: "Mechanism-Based Inactivation of E.coli γ-Glutamylcysteine Synthetase by Phosphinic Acid-and Sulfoximine-Based Transition-State Analogues." Bioorg.& Med.Chem.Lett.6. 1437-1442 (1996)

[Publications] Jun Hiratake: "Aminophosphonic and Aminoboronic Acids As a Key Element of Transition-State Analogue Inhibitor of Enzymes" Biosci.Biotech.Biochem.61. 211-218 (1997)

小田順一京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041)