豚精のう腺で発見された新規リラキシン様物質の遺伝子構成と機能発現機構の解明

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08660338
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 高坂 哲也 茨城大学, 農学部, 助教授 (10186611)
• Keywords: リラキシン様物質 / 遺伝子 / プロモーター領域 / 発現調節 / テストステロン / ブタ / 精のう腺 / 雄特異的発現

Research Abstract

I.リラキシン様物質の遺伝子のエキソン・イントロンの構造
雄豚ゲノムDNAをEcoRIを含む5種類の制限酵素で完全消化させ、本物質cDNAを鋳型としてPCRで作製した種々のプローブを用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った結果、いずれも23.1kbの位置に単一バンドが認められ、本遺伝子はシングルコピージーンであることが明らかとなった。さらに、LongPCRによって本遺伝子のクローニングを行い、塩基配列を決定した。解析の結果、本遺伝子は全長約5kbで、5つのエキソンより構成され、エキソン-イントロンの結合部分はGT-AGルールに合致しており、この部分で正確なスプライシングが行われていることが判明した。
II.リラキシン様物質の遺伝子のプロモーター領域の構造と発現調節機構
雄豚ゲノムDNAを制限酸素ApaIで完全消化した時生じる約2.5KbのDNA断片中に、本遺伝子のプロモーター領域が含まれることを見出した。このDNA断片をショ糖密度勾配遠心で分画し、本cDNAの5'非翻訳配列をプライマーとしてLongPCRを行い、5'上流域のクローン単離した。無細胞転写実験を行い、転写活性を持つ領域を同定し、本遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を決定した。その結果、翻訳開始点の上流約50bp(-50)にTATA-boxを、さらに上流約450bp(-450)にCCAAT-boxを見出した。また、そのさらに上流にはテストステロンのリセプターが特異的に結合するホルモン応答性DNA配列が存在することを突き止め、本遺伝子がテストステロンによって発現誘導されることを明らかにした。