歯周病関連細菌の熱ショック蛋白質の性状とその歯周病原性

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08672372
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 日野出 大輔 徳島大学, 歯学部, 講師 (70189801)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田部 慎一 徳島大学, 歯学部附属病院, 助手 (40284301) ; 大塚 千亜紀 徳島大学, 歯学部, 助手 (00263848) ; 玉谷 香奈子 (大和 香奈) 徳島大学, 歯学部, 助手 (40243711) ; 中村 亮 徳島大学, 歯学部, 教授 (30034169)
• Keywords: 熱ショックタンパク質 / 歯周病原細菌 / 歯周病原性 / 精製

Research Abstract

熱ショック蛋白質(HSP)の研究にあたり、菌の産生するHSPを分離・精製することは、生物学的性状を検索することはもとより、抗体などのTool作製の抗原としても利用できるため、重要である。本研究ではまず、歯周病原細菌であるPorphyromonas gingivalis、Actinobacillus actinomycetemcomitans及びBacteroides forsythusの菌体より主要なHSPであるDnaK様、GroEL様蛋白質の抽出を試みた。各菌体を1mM EDTA,0.2mM TLCK,0.3mg/ml lysozymeを含むトリス緩衝液中でソニケーターにより破砕し、粗抽出液とした。前述のHSPは弱いATP加水分解活性を有することからATP-agaroseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、更に分取電気泳動の手法を用いて精製を進めた結果、P.gingivalis GroEL様及びDnaK様蛋白質、A.actinomycetemcomitans GroEL様蛋白質は1リットルの培養菌体より、それぞれ78μg、155μg、617μgと精製蛋白質のN末端アミノ酸配列の解析及びポリクロナール抗体作成に必要な量の標品を得ることが出来た。B.forsythusは菌の培養が難しいため、7リットルの培養液が必要であったが、GroEL様及びDnaK様蛋白質をそれぞれ225μgと87μg精製することできた。今回用いた精製方法は簡便であり、歯周病原細菌から2種のHSPを同時に精製することができる有効な方法であった。現在、これら精製HSPを用いてポリクローナル抗体を作成中であり、これにより感染症である歯周病の免疫機構との関連性をHSPの性状の検索とともに探究していく予定である。

Research Products

• [Publications] Hinode,D.,Grenier,D.and Mayrand,D.: "A general procedure for the isolation of heat-shock proteins from periodontopathogenic bacteria" Journal of Microbiological Methods. 25. 349-355 (1996)