1996 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト血清コリンエステラーゼ変異遺伝子の発現及びその性状に関する研究
Project/Area Number |
08672651
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Research Institution | Jikei University School of Medicine |
Principal Investigator |
須藤 加代子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (90115486)
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Keywords | ヒト血清コリンエステラーゼ / ブチリルコリンエステラーゼ / 変異遺伝子の発現 / 発現ベクター / 293Cell / 変異導入用プライマー / トランスフェクション / pRc / CMVベクター |
Research Abstract |
発現ベクターへ、クローニングする予定であった、ヒト血清コリンエステラーゼ(ChE)cDNAは、Dr Oksana Lockridgeの好意により、ヒト正常ChEを含むpRc/CMVベクターDNAとして提供を受けた。従ってこの組み換えDNAを大腸菌に導入し、組換え体を確立した。次いで、プラスミドDNAを調製した。ChEの発現には、Human fetal kidney cells(293;American Culture Collection CRL 1573)を用いた。なぜなら293はそれ自身では、ChE活性は示さないからである。調整したプラスミドDNAをリン酸カルシウム法にてトランスフェクションしGENETICIN(Antibiotic G418)を培養液に添加し、セレクションした。発現ChE活性の測定時は、血清無添加培養液(SFRE199-2)を用いた。本発現ベクターをTransfectionした培養液中にのみ、ヒト正常血清の約1/2のChE活性が観察された。 次いで、1.3301(nucleotide no 1201 T--)A)変異体を作成した。L3301変異導入用プライマーにはChEcDNAに認識部位のないSacI認識配列を作り、かつnucleotide no 1201はTにしたものをデザインした。また、pRc/CMVベクターのHindIIIサイトとApaIサイトを含むプライマーをデザインし、前後に分けてPCR増幅した後、それぞれの制限酵素処理し、さらに3者をligetion、transformationした。白色コロニーの中から、8種のプラスミドDNAを調整し、アガロース電気泳動により、その長さを検討し、BglI、SacI消化後のアガロース電気泳動により、その1種にL330変異を持つChEを含むpRc/CMVベクターのインサートを認識した。さらに塩素配列決定により再確認を試みている。
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Research Products
(3 results)
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[Publications] M.Maekawa: "Genetic basis of the silent phenotype of serum butyrylcholinesterase in three compound heterozygotes." Clin.Chim.Acta.235. 41-57 (1995)
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[Publications] K.SUDO: "Three different point mutations in the butyrylcholinesterase gene of three Japanese subjects with a silent phenotype : possible Japanese type alleles." Clinical Cheistry. 29.2. 165-169 (1996)
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[Publications] M.Maekawa: "Genetic mutations of butyrylcholinesterase identified from its phenotypic abnormalities in Japan." Clinical Chemistry. (in press).