1996 Fiscal Year Annual Research Report
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08680695
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
片山 勉 九州大学, 薬学部, 助手 (70264059)
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| Keywords | DnaA / 大量精製 / アフィニティー・ラベル / ATP結合部位 |
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| Research Abstract |
本研究の進行のためには、まず、DnaAタンパク質の安定供給体制の確立が必須であった。従来、DnaAタンパク質は精製が難しいため収量が低く、これが生化学的研究の足かせとなっていたのである。研究代表者はまず、DnaAタンパク質の大量発現系に根本的な改良を加え、菌体全タンパク質の約15%までDnaAタンパク質が蓄積する系を新たに確立した。さらに精製法にも改良工夫を加え、50gの菌体から10mgのDnaAタンパク質を精製できる実験系を見いだした。これは、今まで不可能であったDnaAタンパク質の物理生化学的解析を可能とする突破口を開いたことを意味する。実際我々はCD(円偏光二色性)解析を行ない、初めてDnaAタンパク質の2次構造を解明した。DnaAタンパク質はa-ヘリックスを62%含み、ATPが結合すると構造変化を起こすことが示された。この構造変化によりDnaAは活性を持ち、熱に対し安定となる。さらに、ATP結合部位に結合してDnaAの活性を阻害する新規化学薬剤を見いだした。次に、構造変化による活性化の機構を知るため、DnaAのATP結合部位を明らかにした。タンパク質と共有結合するATP類以体ATP-pyridoxalを用いて、DnaAの親和性標識(アフィニティーラベル)を行なった結果、ATP-pyridoxalは、415番目のアミノ酸(Lys-415)と結合することが分かった。これは、ATPがLys-415を含む領域の構造変化を起こし、DnaAを活性化していることを示唆する(投稿準備中)。
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[Publications] Kubota,T.,and Katayama,T.: "Conformational transition of DnaA Protein by ATP : strutural analysis of DnaA protein,the initiator of Esherichir coli chrorusome replication" Biophys.Biochem.Res.Commun.(印刷中).
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[Publications] Mizushima.T.: "Molecular Design of inhibitors of in vivo oriC DNA replication based on the potential to block the ATP binding of DnaA protein" J.Biol.Chem.271. 25178-25183 (1996)
