スレオニンアルドラーゼ遺伝子のクローニング、構造解析及び有機合成への応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08760097
• Research Institution: Toyama Prefectural University
• Principal Investigator: 劉 吉泉 富山県立大学, 工学部, 助手 (30281249)
• Keywords: threonine aldolase / Site-directed mutagenesis / Aeromonas jandaei / cloning / threonine

Research Abstract

スレオニンアルドラーゼは、グリシンとアルデヒドからβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸を生成する反応、及びその逆反応を触媒する。β-ヒドロキシ-α-アミノ酸は、医薬品原料として有用であり、現在化学合成法により生産されている。しかし本方法では、立体特異性を制御できず、工業的製造の上での障害となっている。かかる背景下、スレオニンアルドラーゼを用いて、安価に供給されるグリシンとアルデヒドから、光学的に純粋なL-スレオ、L-エリスロ、D-スレオ、D-エリスローβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸類を合成する方法の開発が望まれている。本研究では、この新規な合成方法の開発の一環として、Aeromonas jandaeiにより生産されるL-アロースレオニンアルドラーゼ遺伝子の取得・解析を行った.精製酵素のN-末端アミノ酸配列に基づいてプライマーを作成し、PCRにより約110bpの本酵素部分遺伝子の増幅を行った。本断片をプローブに用いてA.jandaei染色体DNAライブラリーとのコロニーハイブリダイゼーションを行い、L-アロースレオニンアルドラーゼ活性を有するクローンを単離した。一次構造解析の結果、本酵素は既知のPLP酵素との相同性は認められなかったが、Saccharomyces cerevisiae由来の機能未知のGLY1蛋白質及びCaenorhabditis elegans由来のGLY1-Like蛋白質とそれぞれ40%と41%の相同性を示した。本酵素においてPLP結合部位と推定された3つのリジン残基を各々アラニンに改変した結果、K199A改変酵素は420nmの吸収ピークを消失し、触媒活性も完全に失った。従って、K199基は本酵素の触媒反応においてPLPとシッフ塩基を形成して、アルドール反応を触媒すると推定された。

Research Products

• [Publications] Ji-Quan Liu: "L-allo-threonine aldolase from Aeromonas jandaei DK-39:gene cloning,nucleotide sequencing,and idetification of the pyridoxal 5'-phosphate binding lysine residue by site-directed mutagenesis" Journal of Bacterilogy. (in press). (1997)