ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序解明・DNAポリメラーゼの解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08770194
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 藤本 秀士 九州大学, 医学部, 講師 (30199369)
• Keywords: ヘリコバクターピロリ- / 遺伝子多様性 / DNAポリメラーゼ

Research Abstract

ヘリコバクターピロリ-の遺伝子多様性の機序を解明するために、この菌のDNAポリメラーゼの解析を試みた。
1、H.pyloriDNAポリメラーゼ遺伝子をクローニングするためのプローブをDegenerated PCRにより作成した。このプローブ作成のためには、Gene bankを検索し、過去に発表されている大腸菌DNAポリメラーゼ遺伝子やTaqDNAポリメラーゼ遺伝子などのアラインメントを行いConserved regionを決定した。その部位を含む最適なPCR primerを選択しdegenerated PCRを行った。その結果、800bpのPCR産物を得た。このPCR産物が目的のものか確認するため塩基配列を決定し、Gene bankのデータベースを用いてホモロジーを検証したところ、大腸菌のDNAポリメラーゼと非常に高い相同性を示し、このPCR産物がDNAポリメラーゼであることが証明された。
2、次に、このPCR産物をプローブとしてH.pylor遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。ライブラリーはUniversity of WashingtonのBerg博士が作成したコスミドライブラリーを用い、コロニーブロットでサザンハイブリダイゼイションを行い陽性のコロニーを探した。約30〜50KbのH.pylori遺伝子断片をもつクローンを70クローンほど検索した結果、目的遺伝子を含むクローンが見つかった。
3.このクローンを数種類の制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い同一プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行って再確認したところ、XbaIフラグメント(約15-20Kb)に目的遺伝子が存在することをつきとめた。このクローンのサブクローニングと塩基配列の決定を行い、目的遺伝子の部分的な塩基配列決定がなされた。現在、全遺伝子配列の決定を試みている。