2008 Fiscal Year Annual Research Report
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08J00077
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
中村 友美 University of Tsukuba, 大学院・人間総合科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | ムスカリン作働性M3アセチルコリン受容体 / シェーグレン症候群 / モノクローナル抗体 |
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| Research Abstract |
M3Rの第二細胞外ループ(M3R_<25>)に対する抗体を有するシェーグレン症候群患者血清中IgGは、ヒト唾液腺細胞株(HSG細胞)を用いた機能解析の実験において、増強または抑制性を示した。しかし、他の自己抗体やM3R抗体の量的影響を除外できないことから、我々はM3R_<25>特異的なモノクローナル抗体を作製することを試みた。
方法はM3R_<25>の合成ペプチドと等量のCFAでエマルジョンを作製したものを6週齢のC57BL/6マウスに2週間毎計3回免疫後、脾臓を摘出しマウスミエローマ細胞株と細胞融合し、HAT選択培地でコロニーのピックアップを行った。その後培養上清をELISA法にてスクリーニングし、M3R_<25>特異的なハイブリドーマリみを大量培養し、その培養上清から抗M3R_<25>モノクロナル抗体を精製した。細胞融合は2回行い、4つのクローンを得ることができた。さらに、このクローンが産生する抗体のアイソタイプいずれもIgG2b・κであることが示された。このモノクローナル抗体を用いて、ヒトリコンビナントM3R蛋白(hrM3R)の検出をウエスタンブロット法にて検討したところ、いずれのモノクローナル抗体もhrM3Rと結合することが認められた。さらに、機能解析の実験として4種類のモノクロニナル抗体をHSG細胞と12時間共培養させた後、M3R特異的アゴニストである塩酸セビメリンを添加したときの細胞内カルシウム濃度を蛍光プレートリーダーで測定したところ、すべての抗M3R_<25>モノクローナル抗体において細胞内シグナルを抑制する傾向が認められた。
以上のことから抗M3R_<25>モノクローナル抗体は、唾液腺上皮細胞において細胞内シグナルを抑制する可能性が考えられた。
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