PQQを補欠分子族とするキノプロテイン脱水素酵素の構造と機能に関する研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09044228
• Research Category: Grant-in-Aid for international Scientific Research
• Section: Joint Research .
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 松下 一信 山口大学, 農学部, 教授 (50107736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 外山 博英 山口大学, 農学部, 助手 (60240884) ; 右田 たい子 山口大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (90159161) ; 三芳 秀人 京都大学, 農学部, 助教授 (20190829) ; 山田 守 山口大学, 農学部, 助教授 (30174741)
• Keywords: ピロロキノリンキノン / キノプロテイン脱水素酵素 / グルコース脱水素酵素 / アルコール脱水素酵素 / X線構造解析 / 酢酸菌

Research Abstract

本研究は、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素とするキノプロテイン脱水素酵素である大腸菌のグルコース脱水素酵素(GDH)および酢酸菌やPseudomonasに存在する異なる3種類のアルコール脱水素酵素(ADH)の構造と機能を、生化学、有機化学、遺伝子工学及びX線構造解析の手法を総合的に駆使して解明することを目的としており、本年度は、以下に示す研究成果を得た。1)大腸菌GDHの構造機能解析:GDHの変異体をランダム変異法で調製し、それらの中で大きく活性を消失した5つの変異体について、その変異部位を明かにするとともに、その部位をさらに部位特異的変異法によって同じ変異が生じることを確認した。そして、それらの変異体を細胞膜からそれぞれ精製し、そのキネティクス分析より、PQQ結合部位にHis775が、さらに分子内電子伝達にR687が関与することを明かにした。2)酢酸菌ADHのユビキノン反応部位の解析:酢酸菌ADHにはユビキノン還元反応とは別にユビキノールを酸化する活性が存在することを発見した。しかも、そのユビキノール酸化部位とユビキノン還元部位が酵素の異なる領域に存在し、異なる立体構造をもつことを、数多くの合成フェノール系およびカプサイシン系ユビキノン阻害剤の阻害スペクトラムとユビキノン類似体の基質特異性の比較から明にした。3)酢酸菌ADH及びPseudomonas ADHのX線構造解析:Pseudomonas putidaのブタノールで誘導される可溶性のADH(ADH IIB)の結晶化に成功し、そのX線解析も1.9Aのレベルで可能となっており、現在重金属置換を進めているところである。また、酢酸菌の膜結合型ADHの結晶化においても最適な界面活性剤とその他の最適化条件を検討中であり、ある条件化では微小結晶が得られている。

Research Products

• [Publications] T.Ikeda et al.: "Electrocatalytic properties of Acetobacter aceti cells immobilized on electrodes for the quinone-mediated oxidation of ethanol" J.Electroanal.Chem.430. 197-204 (1997)
• [Publications] J.Frebortova et al.: "Intramolecular electron transport in quinoprotein alcohol dehydrogenase of Acetobacter methanolicus : A redox-tiration study" Biochim.Biophys.Acta. 1363. 24-34 (1998)
• [Publications] H.Ohshima et al.: "Characterization of the ubiquinone reduction site of mitochondrial complex I using bulky synthetic ubiquinones" Biochemistry. (in press). (1998)