エネルギー代謝系のがん細胞特異性を利用した抗がん剤のデザインとその応用

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09357020
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 寺田 弘 徳島大学, 薬学部, 教授 (00035544)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀 均 徳島大学, 工学部, 教授 (90119008) ; 山崎 尚志 徳島大学, 薬学部, 助手 (20271083) ; 篠原 康雄 徳島大学, 薬学部, 助教授 (60226157)
• Keywords: II型ヘキソキナーゼ / エネルギー代謝 / 酸化的リン酸化 / 解糖系 / 抗がん剤 / ポーリン / 1型グルコース輸送担体 / ミトコンドリア

Research Abstract

がん細胞に選択的なエネルギー代謝を遮断する方法として、ヘキソキナーゼの転写抑制とミトコンドリアへの結合の阻害を挙げている。
本研究では、ヘキソキナーゼのミトコンドリアへの結合阻害実験を行った。これまで、ヘキソキナーゼのミトコンドリアへの結合は、比較的調製が容易である脳のI型ヘキソキナーゼを用いた解析ばかりであり、II型ヘキソキナーゼのミトコンドリアへの結合に関する知見は全く得られていない。そこで、我々がすでに確立した大腸菌での発現系を用いて、インタクトなII型ヘキソキナーゼを発現させ、これをミトコンドリアへの結合実験に供することにした。なお、コントロールとして、Wilson教授の方法に従って、ラットの脳からI型ヘキソキナーゼを調製したものを用いた。
まず、組み換えDNAにより、生体内で発現しているものと1アミノ酸も異ならないタンパク質を発現させる発現ベクターを構築し、大腸菌に発現させた。発現した100kDaのタンパク質をミトコンドリアに添加して結合実験を行ったところ、全く結合が観察されなかった。N末端アミノ酸配列を解析した結果、大腸菌に発現させた100kDaのII型ヘキソキナーゼは、そのN末端の10残基ほどを欠質していることが判明した。そこで、C末側半分のヘキソキナーゼに、第1エクソンに相当する21アミノ酸残基を添加した組み換え体を調製し、これを大腸菌に発現させ、結合の解析を行った。その結果、この組み換え体では、I型ヘキソキナーゼと同等の結合が観察された。
これまで、II型ヘキソキナーゼのミトコンドリアへの結合を測定した例はなかったが、本研究によって、トランケイテッド型ではあるものの、II型ヘキソキナーゼのミトコンドリアへの結合を評価する系をはじめて樹立することができた。

Research Products

• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Fluctuation of the first loop facing the matrix of the mitochondrial ADP/ATP carrier deduced from intermolecular cross-linking of Cys56 residues by bifunctional dimaleimide."Biochemistry. 38. 1050-1056 (1999)
• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Expression of bovine heart mitochondrial ADP/ATP carrier in yeast mitochondria: Significantly enhanced expression by replacement of the N-terminal region of the bovine carrier by the corresponding regions of the yeast carrier,by the corresponding regions"Biochim.Biophys.Acta. 1409. 113-124 (1999)
• [Publications] T.Hatanaka et al.: "Functional expression of the tandem-repeated homodimer of the mitochondria ADP/ATP carrier in Saccharomyces cerevisiae."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 262. 726-730 (1999)
• [Publications] K.Abe et al.: "Effect of endogenous nitric oxide on energy metabolism of rat heart mitochondria during ischemia and reperfusion."Free Radic.Biol.Med.. 26. 379-387 (1999)
• [Publications] K.Kogure et al.: "Potent antiperoxidation activity of the bisbenzylisoquinoline alkaloid cepharanthine: the amine moiety is responsible for its pH-dependent radical scavenge activity."Biochim.Biophys.Acta. 1426. 133-142 (1999)
• [Publications] 寺田 弘: "地球にやさしい化学と環境問題"日本油化学会誌. 48. 401-408 (1999)
• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Irreversible extrusion of the first loop facing the matrix of the bovine heart mitochondrial ADP/ATP carrier by labeling the Cys56 residue with the SH-reagent methyl methanethiosulfonate."J.Biochem.印刷中. (印刷中).
• [Publications] T.Daikoku et al.: "Specific elevation of transcript levels of particular protein subtypes induced in brown adipose tissue by cold exposure"Biochim.Biophys.Acta 印刷中. (印刷中).
• [Publications] Y.Shinohara and H.Terada: "Uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria"Membrane Structure in Disease and Drug Therapy,Edited by G.D.Zimmer,Marcel Dekker,New York.印刷中. (印刷中).
• [Publications] Y.Shinohara and H.Terada: "Roles of hexokinase in aberrant sugar metabolism of tumor cells"Recent Research Development in Bioenergetics,Edited by S.G.Pandalai,Transworld Research NetWork,Trivandrum.印刷中. (印刷中).