テンサイにおける殺虫性外来遺伝子の発現効率の高い新システム開発にに関する基盤研究

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09460001
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 島本 義也 北海道大学, 農学部, 教授 (00001438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金澤 章 北海道大学, 農学部, 助手 (30281794) ; 浅野 真一郎 北海道大学, 農学部, 助手 (60222585) ; 佐野 芳雄 北海道大学, 農学部, 教授 (70109528)
• Keywords: テンサイ / 形質転換 / 殺虫性 / BT遺伝子 / 葉緑体 / 転移酵素 / アグロバクテリウム / ヨトウ

Research Abstract

1)テンサイの葉緑体形質転換系の開発
相同組み換えを利用したテンサイ葉緑体形質転換系を開発するため、テンサイのrbcLやrRNA16Sの近傍の塩基配列を決め、そのた配列をサブクローニングし、選抜因子としてaadA、標識因子としてGUS、プロモタ-として、rrnまたはpsbA、タ一ミネーターとしてrps16を組み込むプラスミドを構築中である。
2)テンサイオルガネラへのタンパク質局在化システムの開発
葉緑体およびミトコンドリアへの輸送ペプチドをコードする塩基配列をタバコよりPCR増幅することによって得た。この配列をGUS遺伝子配列上でタンパク質のN末端をコードする位置に連結させ、これをCaMV35Sプロモーターによって発現させるプラスミドを構築中である。
3)形質転換体テンサイにおけるcry遺伝子の発現
cry1A(b)遺伝子をアグロバクテリウム法で導入し、再分化した10個体の幼葉から全DNAを抽出し、調整し、cry1A(b)遺伝子の両端の配列をプライマーとし、PCRにより増幅し、cry1A(b)遺伝子配列をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、cry1A(b)遺伝子の導入を確認した。また、幼葉から可溶タンパクを抽出し、タンパク質濃度を調整した抽出液を一定量づつ、ナイロンメブレン上にブロットし、ICPに特異的に結合する一次抗体を反応させ、さらにパーオキシダーゼで標識した二次抗体を一次抗体に結合させ、呈色反応によりICPの検出した。
4)テンサイのヨトウガ幼虫に有効なcry遺伝子のスクリーニング
選ばれた3株のcry遺伝子を大腸菌に組み込み、ICPを生産させ、人工飼料に混ぜ、ヨトウガ幼虫を飼い、殺虫性を調査中である。