動物、植物、微生物起源α-グリコシダーゼの構造と基質認識に基づく分子進化

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09460041
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 千葉 誠哉 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (30001449)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (80241363) ; 木村 敦夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (90186312)
• Keywords: 基質認識 / 糖質分解酵素 / 触媒部位構造 / α-グルコシダーゼ / 分子進化

Research Abstract

1.微生物酵素のうち、分裂酵母のものは遺伝子のクローニングに成功した。推定されたアミノ酸一次配列からファミリーII型のα-グルコシダーゼであることを確認した。しかしながら、構造中にI型ファミリーの活性部位を形成するアミノ酸配列が見い出された。異種宿主で酵素遺伝子の高発現が可能であるので、点突然変異法でアミノ酸置換を試みた。いずれの変異体も活性を保持しており、I型ファミリーの活性部位に近似する配列は本酵素で機能していないことが推定された。Schanniomyces ocidentalisの酵素はグルコアミラーゼと報じられているが、α-グルコースを生成し、多糖類よりオリゴ糖に高い特異性があることが明らかになり、α-グルコシダーゼであることが判明した。エドマン法で解析したアミノ酸配列から、II型ファミリーに属すと考えられる。
2.ブタ血液からα-グルコシダーゼを大量に精製した。自殺基質法と速度論的解析から活性発現に直接関与する活性解離基を調べ、2つのカルボキシル基であることが判明した。プロテアーゼ消化に供し、得られたペプチドのアミノ酸配列からファミリーII型酵素であると推定した。
3.本計画3年間で明らかになった知見からα-グルコシダーゼは二つのファミリーに分類可能と思われる。両者の一次構造に保存性が見い出せず、一方がα-アミラーゼの活性部位を進化的に保持していた。他方はα-グルコシダーゼに特異的であった。これらの結果から、α-グルコシダーゼの収斂進化(異なる祖先蛋白から別々な進化を行い、生物機能が同一の蛋白になる)が予想された。

Research Products

• [Publications] 永坂 曜介: "Corticium rolfsiiのグルコアミラーゼに関する研究"応用糖質科学. 46(2). 169-178 (1999)
• [Publications] T. Mizuno: "Molecular cloning of Isomltotrio-dextranase Gene from Brevibacterium fascum var. dextranlycum strain 0407 and Its Expression in Esherichia coli"Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(9). 1582-1588 (1999)
• [Publications] 千葉 誠哉: "グリコシダーゼの分子機構に関する研究"日本農芸化学会誌. 73(10). 1001-1012 (1999)
• [Publications] R.S.-Jin: "Purification and partial characterization of A Novel Glucanhydrolase from Lipomyces starkey, KSM22 and Use for Inbibition of Insoluble Glucan formation"Biosci .Biotechnol. Biochem. (印刷中). (2000)
• [Publications] 木村淳夫: "ω-Epoxyalkyl α-glucosideによるグリコシダーゼの親和標識"応用糖質科学. (印刷中). (2000)
• [Publications] 木村淳夫: "澱粉粒の酵素分解に見い出された生成物の"固定化現象""BRAINテクノニュース. 72(3). 27-29 (1999)