原核細胞cDNAライブラリーの構築とサブトラクション法による遺伝子カタログ化 -P.gingivalisの病原因子に関与する新規遺伝子のクローニング-

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09470405
• Research Institution: Nihon University School of Dentistry at Matsudo
• Principal Investigator: 安孫子 宜光 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (70050086)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木山 道子 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (50256905) ; 平塚 浩一 日本大学, 松戸歯学部, 助手 (80246917) ; 城座 映明 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (50271333)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / サブトラクション / 欠損株 / cDNA

Research Abstract

本研究は、原核細胞のcDNAライブラリーの構築、新規遺伝子のカタログ化などの先端技術を実用化させ、実験モデルとして歯周病原細菌の新たな病原遺伝子の検索とコードタンパク質の機能解析を目的とした。近年、主要な歯周病原細菌であるP.gingivalisの病原性とヘミンが密接な関係にあることが報告されてきている。そこで、ヘミンで誘導される遺伝子の探索と機能解析を行う目的で、P.gW83株をヘミン制限下と過剰下に培養し、集菌後、全RNAを分離した。ここからrRNAを除去する目的で16Sおよび23SrRNA遺伝子上にビオチンラベルのPCRプローブを設定し、染色体DNAから作られた産物を用いて、サブトラクトし、ストレプトアビジン磁気ビーズにてこれを除去した。サンプルの一方をビオチンラベルしたcDNAを合成し、精製に限界ろ過フィルタ-を用いることで、サイズの小さな5SrRNAやtRNAを除去した。得られたcDNA同士をサブトラクトすることで、ある条件下で特異的に発現してる遺伝子のみを残した。これをクローニングベクターに挿入し、大腸菌にトランスフォーメーションすることでcDNAライブラリーを作製した。当研究室では既に本菌に特異的な外膜タンパク質の遺伝子のクロ-ニングに成功しており、この遺伝子がヘミン結合タンパク質の一つである可能性が示唆されていたので、ライブラリ-から本遺伝子をプローブにしてスクリーニングして得られた陽性クローン遺伝子解析を行ったところ、本外膜タンパク質遺伝子であることが確認された。この遺伝子の欠損株を作製し、解析を試みたところ、欠損株は他の菌体との共凝集能、自己凝集能、上皮細胞への付着能、赤血球凝集能、各種プロテアーゼ分泌能など様々な病原性が低下してることが判明した。このように原核細胞におけるサブトラクションによるカタログ化は有用な手段になると思われた。