ホルマリン固定標本を用いた絶滅種・希少種のDNA分析による系統類縁解析の試み

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09839032
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 井田 齊 北里大学, 水産学部, 教授 (90050533)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 朝日田 卓 北里大学, 水産学部, 講師 (00296427) ; 林崎 健一 北里大学, 水産学部, 講師 (80208636)
• Keywords: 絶滅種 / 希少種 / 系統 / mtDNA / PCR / ホルマリン固定標本 / シトクロームb

Research Abstract

絶滅種・希少種の系統を解析する目的で、ホルマリン固定された長期保存標本からのDNA抽出手法およびDNA多型の解析手法に関して検討を行った。
DNA抽出に関しては(1)組織の物理的粉砕、(2)組織溶解に先立つホルムアルデヒドの不活化処理、(3)プロティナーゼKによる組織溶解の条件の最適化、(4)組織溶解液からのDNAの回収条件の最適化という四つのポイントに関して、既報の情報と併せてDNA抽出手法の改良を行った。(1)に関してはBIO 101社の専用機とキットを用いることで処理時間の短縮と効率化が可能であった。この処理の後トリス・グリシンバッファーにより(2)の処理を行った。さらに4M尿素を含むバッファーを用いて55℃でプロティナーゼKの連続添加が、(3)の組織溶解に関しては最適であった。また、(4)に関しては現在なお検討中であるが、塩析法により除タンパクを行った後にエタノール沈殿を行うことにより、DNAの回収を行っている。
DNA多型の解析に関しては、回収されたDNAにRAPD法を用いると明瞭なバンドパターンを示さず、スメア状になることで明らかなように、DNAの断片化が進んでいるために、PCR法による目的領域の増幅が必須である。PCR増幅が可能な長さに関しても、今後さらに検討する必要があるが、本研究における実験ではシトクロームb領域の約500塩基対の増幅が可能であった。過去の報告からも800塩基対程度の増幅がせいぜいであることから、多型解析には高精度のデータが得られる塩基配列決定が必要となるであろう。本研究では10年〜20年ホルマリン中に保存されていた、シロサケおよびリュウキュウアユの数個体について上記領域の増幅が可能であることを確認した後、シロサケの1個体について、遺伝子組み換え手法を用いた塩基配列の決定を行い、487塩基対の解析に成功した。