2009 Fiscal Year Annual Research Report
Gタンパク質シグナル伝達を可視化する発光プローブの開発
Project/Area Number |
09F09051
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Research Institution | The University of Tokyo |
Principal Investigator |
小澤 岳昌 The University of Tokyo, 大学院・理学系研究科, 教授
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
A.K.M. Kafi 東京大学, 大学院・理学系研究科, 外国人特別研究員
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Keywords | GPCR / ルシフェラーゼ / 薬剤スクリーニング |
Research Abstract |
本申請研究では,Gタンパク質共益受容体(GPCR)とそのシグナル伝達に重要な細胞質局在タンパク質β-arrestinとの相互作用を,生きた細胞下で検出する発光プローブを開発する.プローブの原理は2断片に分割した発光タンパク質ルシフェラーゼを用い,それぞれをGPCRおよびβ-arrestinへ融合させる.GPCRとβ-arrestinが相互作用した場合,ルシフェラーゼ断片が接近し再構成の原理により全長ルシフェラーゼが構成され,発光能が回復する. 検出プローブに使用するルシフェラーゼとして,発光強度の高いエメラルドルシフェラーゼを選択した.このルシフェラーゼ断片をそれぞれGPCRおよびβ-arrestinへ融合して,GPCRの種類に応じて複数の検出プローブを作製した.さらに,この検出プローブを安定的に発現する培養細胞株を樹立した.実際にGPCRの活性を上昇させるリガンドを加えた場合に相互作用が発光として検出される事を確認した. 通常,GPCRは細胞膜に局在し,リガンドの結合によってβ-arrestinと結合し膜から解離して細胞質中へ局在が移行する.そのダイナミクスを1細胞下で検出することを目的として,顕微鏡下での発光イメージングを行った.細胞株に対して基質ルシフェリンを投与し,リガンドを加えることでその発光反応の検出を試みた.結果,リガンドを加えて10-20分後に膜上で発光の輝点が確認され,そのうちのいくつかは細胞質中へ移行する様子が観察された.またこの発光輝点は時間経過とともに消失することから,GPCRとβ-arrestinの相互作用をその解離までを発光イメージングで追跡できることが証明された.
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Research Products
(1 results)