2009 Fiscal Year Annual Research Report
頂底極性決定因子CrumbsのmRNA局在化機構の解析
| Project/Area Number |
09J01309
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
飯岡 英和 Kobe University, 理学研究科, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Keywords | Crumbs / 細胞極性 / RNA / 頂底極性 / 上皮細胞 / RNA結合タンパク質 |
|---|
| Research Abstract |
本研究の目的は、上皮組織の発生やガンの浸潤等と密接に関わっている頂底極性について、その成り立ちを明らかにすることである。頂底極性の形成に必須の遺伝子Crumbs(Crb)は、上皮細胞の頂部側に局在する膜タンパク質をコードしている。近年ショウジョウバエの研究から、CrbのmRNAが上皮細胞の頂部側に局在していることが明らかになった。このことからRNAの局在制御がCrbタンパク質の局在、機能、ひいては頂底極性の形成に何らかの役割を果たしていると考えられるが、詳細は不明である。
本研究ではCrb mRNAに結合・局在化させるタンパク質を同定してmRNA局在化の制御機構を明らかにし、頂底極性形成における役割を示すことを最終目標とする。今年度はまずCrb mRNAの頂部側への局在に必須の配列「局在化エレメント」を同定するため、mRNAを上皮細胞内で可視化する方法を立ち上げることを第一の目標とした。また局在化エレメントに結合するタンパク質を生化学的に同定するため、RNAを用いたタンパク質沈降実験の検討・立ち上げも第二の目標として並行して行った。
当初予定していたMS2-GFPラベリング法による細胞内RNAの可視化は、条件検討した範囲ではうまく働かなかった。しかし、FISH法により内在のCrb mRNAを可視化することができた。これにより、RNA局在化エレメントを同定するレポーターアッセイが可能となった。またタンパク質沈降実験についても、パイロット実験の段階ではRNAアプタマーを効果的に用いることで、ベイトRNAに特異的に結合するタンパク質を分離することができた。結果として本年度の目標は、二つのアッセイを立ち上げたことでほぼ達成できたと考えている。今後はこれらの方法を駆使して、局在化エレメントの同定、結合タンパク質の同定、さらに培養細胞等を用いた機能解析を行う。
|
