新規フォールディングRNA修飾酵素のRNA認識機構の解明

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09J10011
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 越智 杏奈 Ehime University, 理工学研究科, 特別研究員(PD)
• Keywords: 核酸 / 酵素 / 生体分子 / ゲノム / 進化

Research Abstract

平成21年は、計画していた通り、トレフォイル・ノット型酵素であるtRNA(Gm18)methyltransferase[TrmH]のRNA認識機構の解明を中心に研究を行った。
(1)TrmHの基質tRNA認識メカニズムの解明
TrmHによってメチル化されるG18およびその周辺に変異を導入したtRNA mutantを作製し、TrmHとの相互作用の解析を行った。その結果、今まで最小認識部位とされてきたG18G19配列は、大きく影響しているが必ずしも必要ではなく、TrmHはD-loop中のGuanine塩基を比較的Flexibleに認識していることが判った。また、このときの認識部位は6位酸素原子であると考えられる。さらに、メチル化されたtRNAはTrmH活性中心より、AdoMetとの立体障害によって排除されていることが示唆された。
(2)TrmHと基質tRNA結合におけるpre-steady state kinetics
統合バイオサイエンスセンターの桑島先生・真壁先生にご協力のもと、Stopped-flow蛍光分析によりpre-steady state kineticsを行った。結果、TrmH-tRNA Complexの形成は、First Binding ProcessおよびStructural Change Processを含む、少なくとも3つ以上のステップから構成されていることを証明することが出来た。
(3)TrmH-tRNA ComplexのX線結晶構造解析
tRNA G18をデオキシ体に変えたDNA-RNAキメラ核酸を作製した。これはTrmHと結合後、メチル化が起こらず解離反応が進まないため、TrmH活性中心と非常に強く結合していると考えられる。このようなキメラ核酸を用いて結晶化を試みたが、結晶は出たものの、TrmH単独のものであった。

Research Products

• [Journal Article] Flexible Recognition of the tRNA G18 Methylation Target Site by TrmH Methyltransferase through First Binding and Induced Fit Process (2010)
  • Author(s): A.Ochi, K.Makabe, K.Kuwajima, H.Hori
  • Journal Title: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 285 Pages: 9018-9029
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aquifex aeolicus tRNA(N^2, N^2-Guanine)-dimethyltransferase(Trm1)Catalyzes Transfer of Methyl Groups Not Only to Guanine 26 but Also to Guanine 27 tRNA (2009)
  • Author(s): T.Awai, S.Kimura, C.Tomikawa, A.Ochi, Ihsanawati, Y.Bessho, S.Yokoyama, S.Ohno, K.Nishikawa, T.Yokogawa, T.Suzuki, H.Hori
  • Journal Title: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284 Pages: 20467-20478
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Flexible recognition of methylation targes site, guanosine at position 18 in tRNA(Gm18)methyltransferase[TrmH] (2010)
  • Author(s): A.Ochi, H.Hori
  • Organizer: 23^<rd> tRNA workshop Portugal 2010
  • Place of Presentation: Aveiro, Portugal
  • Year and Date: 2010-01-29
• [Presentation] Characterization of TrmJ[Transfer RNA(Cm32/Um32)Methyltransferase]Ortholog(TK1970)from a Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakarensis (2010)
  • Author(s): A.Hirata, A.Ochi, C.Tomikawa, T.Kitajima, T.Kanai, H.Hori
  • Organizer: 23^<rd> tRNA workshop Portugal 2010
  • Place of Presentation: Aveiro, Portugal
  • Year and Date: 2010-01-29
• [Presentation] Multi-site substrate recognition mechanism of Aquifex aeolicus Trm1 (2010)
  • Author(s): T.Awai, Ihsanawati, S.Kimura, C.Tomikawa, A.Ochi, T.Yokogawa, T.Suzuki, Y.Bessho, S.Yokoyama, H.Hori
  • Organizer: 23^<rd> tRNA workshop Portugal 2010
  • Place of Presentation: Aveiro, Portugal
  • Year and Date: 2010-01-29
• [Presentation] Transfer RNA Methyltransferases from a Hyperthermophilic Eubacterium, Aquifex aeolicus (2010)
  • Author(s): H.Hori, T.Awai, T.Toyooka, C.Tomikawa, H.Okamoto, H.Takeda, K.Watanabe, A.Ochi, A.Hirata, S.Kimura, Y.Ikeuchi, T.Yokogawa, T.Suzuki
  • Organizer: 23^<rd> tRNA workshop Portugal 2010
  • Place of Presentation: Aveiro, Portugal
  • Year and Date: 2010-01-29
• [Presentation] 超好熱性真性細菌Aquifex aeolicu由来Trm1[tRNA(m^2_2G26)methyltransferase] のtRNA認識機構と構造の相関 (2009)
  • Author(s): 粟井貴子、Ihsanawati、木村聡、冨川千恵、越智杏奈、横川隆志、鈴木勉、、別所義隆、横山茂之、堀弘幸
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2009-12-12
• [Presentation] Thermus thermophilus HE8 tRNA(Gm18)methyltransferase [TrmH]のtRNA G18 認識メカニズム (2009)
  • Author(s): 越智杏奈、堀弘幸
  • Organizer: 第11回日本RNA学会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2009-07-28
• [Presentation] マルチサイト特異性RNAメチル化酵素のtRNA認識機構 (2009)
  • Author(s): 粟井貴子、木村聡、冨川千恵、越智杏奈、Ihsanawati、別所義隆、横山茂之、横川隆志、鈴木勉、堀弘幸
  • Organizer: 第11回日本RNA学会
  • Place of Presentation: 新潟
  • Year and Date: 2009-07-28