気道で発見した2種のトリプターゼの遺伝子工学的合成と、疾患の診断と治療への応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557057
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 安岡 劭 徳島大学, 医療技術短期大学部, 教授 (30035414)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 陽一 徳島大学, 医学部附属病院, 講師 (00237447) ; 小山 一 徳島大学, 医学部, 助教授 (80109074) ; 佐野 壽昭 徳島大学, 医学部, 教授 (80154128) ; 益田 賢一 帝人(株), 創薬第2研究所, 主任研究員
• Keywords: ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ / 気道 / 遺伝子構造 / 組換え酵素 / モノクロナール抗体 / 免疫組織化学 / 遺伝子多型 / プロウロキナーゼ

Research Abstract

1. ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT)の遺伝子のクローニングと組換え標品の生合成の問題:HATの遺伝子をクローニングし、これをバキュロウイルスをベクターとし昆虫細胞に組み込み、成熟型HATを生合成する系を構築した。この系で、成熟型HATにまで転換する標品より、前駆体HATの状態に止まっている標品の割合が多いことが判明した。この前駆体を成熟型に活性化する方法を種々検討した。
2. HATの気道における局在部位の検索:バキュロウイルス/昆虫細胞系で組換えHATを生合成し、これに対するマウスモノクロナール抗体を作成した。この抗体を一次抗体とし、肺手術時に採取した気管支を対象とし、超感度免疫組織染色法でHATの局在部位を検索した。その結果、HATが気道上皮細胞で生合成されることを示唆する成績が得られた。
3. HATの内因性タンパク分解能の検索:HATの血清および気道液中の主要タンパク分解能を電気泳動法で検索した結果、HATはプロウロキナーゼを特異的に限定分解してウロキナーゼに転換(活性化)することと、フィブリノーゲンを分解してそのフィブリンへの転換を抑制することが明らかになった。プラスミンが結合組織成分を分解するコラゲナーゼやストロメライシンなどの金属プロテアーゼを活性化することから、HATが線溶系を活性化することは、HATの生理的機能や病態的意義を解明する上で重要と考えている。
4. HATの遺伝子多型の診断的意義に関する基礎的研究:HATのcDNA構造と、既知のトリプシンファミリーのプロテアーゼの遺伝子構造とを比較することによって、成熟型HATの遺伝子構造を推定した。これをもとにヒト白血球ゲノムを増幅し、検討した結果、HATには3つのイントロンが存在することが明らかになり、N末側よりA、B、Cと命名した。このイントロン部分を種々の制限酵素で分解した結果、Mbo1およびBstU1によって遺伝子多型が存在することが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Susumu Yasuoka: "Purification,characterization,and localization of a novel trypsin-like protease found in the human airway" Am J Respir Cell Mol Biol. 16・3. 300-308 (1997)
• [Publications] Kazuyoshi Yamaoka: "Cloning and characterization of cDNA for human airway trypsin-like protease" J Biological Chemistry. 273・19. 11895-11907 (1998)
• [Publications] Sumiko Yoshinaga: "Fibrinogenolytic activity of a novel trypsin-like enzyme found in human airway" The Journal of Medical Investigation. 45・1〜4. 77-86 (1998)