α-ガラクトフラノース構造をもつ新規N-型糖鎖の分子機構

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10660068
• Research Institution: HOKKAIDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 木村 淳夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (90186312)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (80241363) ; 千葉 誠哉 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (30001449)
• Keywords: N-グリコシド型糖鎖 / O-グリコシド型糖鎖

Research Abstract

微生物には、哺乳動物や植物に見られないN-あるいはO-型糖鎖が存在する。が、その生物機能や生合成機構については解明されていない。本研究は、その新規なO-型糖鎖の解明ならびに5員環ガラクトース(以下、Galfと略す)がα型で結合する新規なN-型糖鎖の生合成に関する酵素(UDP-Galf合成酵素とGalf転移酵素)の解析を目的として行われ、本年度は以下に示す成果が得られた。
1)Aspergillus nigerのα-グルコシダーゼに存在するO-型糖鎖に関し、本年度は三糖類に焦点を絞って構造解析を行った。昨年度の部分精製画分からマンノースのみから成る三糖を2種類単離した(ミリマスで分子量や構造式を推定後、単糖分析した)。構成単糖における結合アノマー型はαであり、1Dや2D-NMRにより分岐型のマンノトリオースと決定した。もう一種類の糖鎖は、同様な解析から直鎖マンノトリオースと推定された。しかし、還元末端マンノースに対する結合部位が決定できず、NaBD_4を用いた還元・β-脱離反応により重水標識した試料を精製後、2D-NMRにより結合部位を明らかにした。後者は新規なO-結合型糖鎖であった。
2)Aspergillus niger 抽出液の UDP-Galf合成酵素とGalf転移酵素の活性は微弱であるため、菌体の培養条件を検討した。マントースやデンプンの添加で糖化酵素(分泌蛋白)の誘導とともに両酵素活性も上昇した。菌体抽出の際に失活が大きいことが認められたが、界面活性剤の共存で特にGalf転移酵素の安定化が認められた。各種クロマト操作で電気泳動的に単一ではないが、純度の高い標品を得た。アミノ酸配列解析を目指して両酵素の大量調製を行っており、得られた配列から遺伝子の単離を図りたい。

Research Products

• [Publications] 永坂 曜介: "Corticium rolfsii のグルコアミラーゼに関する研究"応用糖質科学. 46(2). 169-178 (1999)
• [Publications] T.Mizuno: "Molecular cloning of Isomltotrio-dextranase Gene from Brevibacterium fuscum var. dextranlycum strain 0407 and its Expression in Escherichia coli"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 63(9). 1582-1588 (1999)
• [Publications] 千葉 誠哉: "グリコシダーゼの分子機構に関する研究"日本農芸化学会誌. 73(10). 1001-1012 (1999)
• [Publications] R.S.-Jin: "Purification and Partial Characterization of A Novel Glucanhydrolase from Lipomyces Starkey, KSM 22 and Use For Inbibition of Insoluble Glucan Formation"Biosci. Biotechnol. Biochem.. (印刷中). (2000)
• [Publications] 木村 淳夫: "ω-Epoxyalkyl α-glucosideによるグリコシダーゼの親和標識"応用糖質科学. (印刷中). (2000)
• [Publications] 木村 淳夫: "澱粉粒の酵素分解に見い出された生成物の"固定化現象""BRAINテクノニュース. 72(3). 27-29 (1999)