脳発達におけるアストロサイト由来神経栄養因子の役割-GMF・B,GMF・γ,Gliostatinの分子作用機構-

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670747
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 浅井 清文 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (70212462)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 泰治 名古屋市立大学, 医学部, 教授 (60094364)
• Keywords: グリア細胞成長因子 / GMF / アストロサイト

Research Abstract

研究方法及び結果
1、 グリア細胞成長因子-β(GMF-β)、GMF-γの特異的抗体の作製
ヒトGMF-β、GMF-γcDNAを発現ベクターpAED4にligationし大腸菌BL21(DE3)に導入した。この大腸菌で発現させたリコンビナントGMF-β、GMF-γを、ウサギに免疫しポリクローナル抗体を得た。GMF-β、GMF-γは相同性が高いため、これらのポリクローナル抗体は互いに交差反応することが判明した。そこで、GMF-β、GMF-γを固定化したアフィニティーカラムを作成し、抗GMF-β抗体はGMF-γ固定化カラムで処理し、抗GMF-γ抗体はGMF-β固定化カラムで処理し、互いに交差反応する抗体を除去し特異的に反応する抗体だけを精製した。Western blotで検討したところ、100倍以上に抗体液を希釈すれば、交差反応は全く観察されなかった。今後、この抗体を免疫組織、ELAに利用していく予定である。
2、 GMF-β、GMF-γのRNAのRT-PCR法による定量法の確立
ヒトGMF-β、GMF-γのcDNA配列より新たに効率よく増幅のできるPCR primerを設計した。定法に従い、これらのprimerを用いてRT-PCRを行い、ヒトGMF-β、GMF-γのmRNAの検出を行った。その結果、これらのprimerを使用すれば、ホモロジーの高いヒトGMF-βGMF-γも交差反応することなく検出することができることを確認した。現在は、このprimer setを使用し、定量性のあるRT-PCRの確立を目指し検討している。