がん細胞における酸化的リン酸反応と解糖系の共役を担うポーリンの機能解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10672042
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 篠原 康雄 徳島大学, 薬学部, 助教授 (60226157)
• Keywords: ポーリン / エネルギー代謝 / 酸化的リン酸化 / ミトコンドリア / 解糖系 / 抗がん剤

Research Abstract

申請者はこれまでに、がん細胞に発現した3種のポーリンのクローン化を済ませていたが、他のアイソフォームの発現の可能性については検討できていなかった。そこで、本年は、縮重プライマーを用いたPCRにより、第4のポーリンの発現の可能性を検討した。
縮重プライマーのデザインに際しては、すでに構造を明らかにした3種のポーリン間で高度に保存されている領域を指標に行った。
調製したプライマーでPCRを行うのに先立ち、まずこれですでに構造解析を行った3種のポーリンのcDNAが均等に増幅されるかどうかの解析を行った。その結果、同じ量の鋳型を用いても、増幅され可視化されるDNA量に顕著な差が認められたため、まずこれらのcDNAが均等に増幅される条件の検索を行った。その結果、プライマーのアニーリング温度を41度まで低下させることにより、3種のcDNAが均等に増幅されることが判明した。
そこで、この条件下、AH130のcDNAを鋳型としたPCRを行った。増幅されたDNA断片をサブクローニングし、これで大腸菌を形質転換して得られた組み換え体を無作為に64クローン選択し、これらがいずれのポーリンのcDNAであるのか解析した。その結果、64クローン中、7クローンが1型、30クローンが2型、14クローンが3型であった。残りの13クローンはいずれのcDNAでもなかったが、これらの塩基配列を解析した結果、非特異的な増幅によるものであることが判明した。
このような穏やかな条件下でのPCRでも、第4のポーリンがとらえられなかったことから、我々はがん細胞で第4のポーリンが発現している可能性はないと結論した。

Research Products

• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Fluctuation of the first loop facing the matrix of the mitochondrial ADP/ATP carrier deduced from intermolecular cross-linking of Cys56 residues by bifunctional dimaleimide."Biochemistry. 38. 1050-1056 (1999)
• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Expression of bovine heart mitochondrial ADP/ATP carrier in yeast mitochondria:Significantly enhanced expression by replacement of the N-terminal region of the bovine carrier by the corresponding regions of the yeast carrier by the corresponding regions"Biochim.Biophys.Acta. 1409. 113-124 (1999)
• [Publications] T.Hatanaka et al.: "Functional expression of the tandem-repeated homodimer of the mitochondrial ADP/ATP carrier in Saccharomyces cerevisiae."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 262. 726-730 (1999)
• [Publications] 原島秀吉、篠原康雄、際田弘志: "キャリアーによる細胞内デリバリー戦略と今後の課題"Drug Delivery System. 14. 157-164 (1999)
• [Publications] M.Hashimoto et al.: "Irreversible extrusion of the first loop facing the matrix of the bovine heart mitochondrial ADP/ATP carrier by labeling the Cys56 residue with the SH-reagent methyl methanethiosulfonate."J.Biochem.. (印刷中).
• [Publications] T.Daikoku et al.: "Specific elevation of transcript levels of particular protein subtypes induced in brown adipose tissue by cold exposure"Biochim.Biophys.Acta. (印刷中).
• [Publications] Y.Shinohara and H.Terada: "Uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria"Membrane Structure in Disease and Drug Therapy,Edited by G.D.Zimmer,Marcel Dekker,New York.. (印刷中).
• [Publications] Y.Shinohara and H.Terada: "Roles of hexokinase in aberrant sugar metabolism of tumor cells"Recent Research Development in Bioenergetics,Edited by S.G.Pandalai,Transworld Research NetWork,Trivandrum.. (印刷中).
• [Publications] H.Harashima et al.: "Intracellular control of gene trafficking using liposome as drug carriers"Eur.J.Pham.Sci.. (印刷中).