2000 Fiscal Year Annual Research Report
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の基質認識機構の解析
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10680612
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| Research Institution | OKAYAMA UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
田中 英彦 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (90065912)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 隆 岡山大学, 農学部, 助教授 (40253009)
稲垣 賢二 岡山大学, 農学部, 教授 (80184711)
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| Keywords | イソクエン酸脱水素酵素 / イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素 / 基質認識部位 / 変異導入プライマー / X線結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
昨年、本研究室で作製した形質転換体JM109-pKKleuB1 mutは目的タンパク質(変異酵素タンパク質)を発現してないものと考えていたのだが、SDS-PAGE実験において大腸菌タンパク質、菌体破砕後の不溶性画分タンパク質、不溶性画分タンパク質の3種類のサンプルを用いたところ、大腸菌内で目的タンパク質は発現しているが、不溶性の封入体として回収されていることが判明した。
本年度は、目的タンパク質を可溶性画分に回収することを目的として、目的タンパク質に低分子タグ(Hisタグ)を付加させたものと融合タンパク質としたものの二種類を大腸菌内で発現させることにした。Hisタグ付加用のベクターにはpET-15bを、融合タンパク質用のベクターにはpMAL-c2を用意した。この各々のベクターに変異酵素遺伝子(leuB mut)を導入し、前者はE.coli BL21株に、後者はE.coli JM109株に組み込んだ(形質転換)。そして、前者の形質転換体から獲得したプラスミドをpETleuB1 mut、後者の形質転換体から獲得したプラスミドをpMALleuB1 mutとした。
次に、この2つの形質転換体内で目的タンパク質が発現しているかを確認するためにSDS-PAGEを行った。形質転換体の培養温度条件は37℃、30℃、24℃で検討した。この結果、可溶性画分に目的タンパク質を回収できたのはJM109-pMALleuB1 mutを30℃で培養した時であった。そのため、酵素活性測定にはJM109-pMALleuB1 mutを30℃で培養したものを用いたのだが、3-IPMDH活性・ICDH活性ともに見ることができなかった。
今後は、融合タンパク質のMBP(maltose binding protein)を切り離した酵素の活性を測定する予定である。
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Research Products
(7 results)
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[Publications] Kawaguchi,H.,K.Inagaki,H.Matsunami,Y.Nakayama,T.Tano,H.Tanaka: "Purification and Characterization of 3-Isopuropylmalate Dehydrpgenase from Thiobacillus thiooxidans"J.Biosci.Bioeng.. 90(4). 459-461 (2000)
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[Publications] Inoue,H.,K.Inagaki,N.Adachi,T.Tamura,N.Esaki,K.Soda and H.Tanaka: "Role of Tyrosine 114 of L-Methionine γ-Lyase from Pseudomonas putida"Biosci.Biotech.Biochem. 64・11. 2332-2339 (2000)
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[Publications] Ohhira,I.,T.Tamura,H.Kurokawa,H.Nakaue,K.Inagaki,and H.Tanaka: "Purification of anti-Escherichia coli O-157 components produced by Enterococcus faecalis TH10, an isolate from Malaysian fermentation food, Tempeh"Milk Science. 49・2. 81-88 (2000)
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[Publications] Seow,T.-K.,K.Inagaki,T.Nakamura,R.Maeda,T.Tamura,and H.Tanaka: "Purification and Some Characteristics of a Monomeric Alanine Racemase from an Extreme thermophile, Thermus thermophilus"J.Biosci.Bioeng. 90・3. 344-346 (2000)
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[Publications] Tamura,T.,Y.Oki,A.Yoshida,T.Kuriyama,H.Kawakami,H.Inoue,K.Inagaki and H.Tanaka: "Noncompetitive, reversible inhibition of aminoacylase-l by a series of l-α-hydroxyl-and l-α-fluoro-fatty acids; the ligand specificity of Aspergillus oryzae and porcine kidney enzymes"Archives Biochem.Biophys.. 379・2. 261-266 (2000)
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[Publications] Lim,L.-C.,T.Tamura,R.Rahim,M.Ali,H.Ghazali,K.Inagaki and H.Tanaka: "A colourimetric screening method for microorganisms that have methionine γ-lyase activity"Asia Pacific J.Mol.Biol.Biotech.. 8・1. 95-97 (2000)
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[Publications] Motoshima,M.,K.Inagaki,T.Kumasaka,M.Furuichi,H.Inoue,T.Tamura,N.Esaki,K.Soda,N.Tanaka,M.Yamamoto,and H.Tanaka: "Crystal Structure of the Pyridoxal-5'-phosphate Dependent L-methionine γ-lyase from Pseudomonas putida"J.Biochem.,. 128・3. 349-354 (2000)
