X染色体上のRFLPマーカーを用いた内分泌臓器結節性病変のclonality解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10770079
• Research Institution: 大分医科大学
• Principal Investigator: 加島 健司 大分医科大学, 医学部, 助教授 (90244160)
• Keywords: X染色体 / RFLP / HUMARA法 / Clonality解析 / 内分泌臓器

Research Abstract

1. パラフィンブロック組織からDNAを抽出し、X染色体androgen receptor(AR)遺伝子をPCRにて検出した。その知見は以下の通り。
(1) 固定時間が24〜48時間を越える組織から得られたDNAは断片化を来し、PCRによる増幅不良であった。
(2) 固定条件が良好な組織を選択し、さらに新たに入手した組織を24時間以内で固定したところ、安定した増幅結果が得られた。約半数の症例がAR遺伝子に関してヘテロであり、解析対象となった。
(3) バセドウ病甲状腺組織ならびに腺腫様甲状腺組織ではHpaIIによる切断でも2本のバンドは消失せず、polyclonalな増殖と推定された。なお、ヒト子宮内膜癌培養細胞から抽出したDNAをHpaII処理の陽性対照としている。結果の判定には申請備品のフィルムスキャナーとコンピューターを用いた。
(4) 予想に反して、典型的な甲状腺濾胞腺腫ならびに濾胞腺癌もpolyclonalな増殖を示した。さらに、甲状腺乳頭腺癌もpolyclonalと判定された。
2. 上記(4)の結果は、腫瘍組織内の間質細胞DNAによる干渉に起因すると推定し、Dynal社製Magnet-beads(BerEP4抗体結合)を用いて、腫瘍組織からの癌細胞選択的採取を試みた。その知見は以下の通り。
(1) 組織消化条件(酵素の種類、時間、破砕方法など)を調節した結果、乳頭癌細胞は1〜3個の、リンパ球やfibroblastなどの間質細胞は単個に分離でき、BerEP4-coated magnet-beadsにより、ほぼ癌細胞のみからなる細胞集団を分取できた。
(2) この(癌)細胞集団のDNAを解析した結果、一方のバンドの減弱が認められ、monoclonalな細胞集団と判定できた。現在、この手法の安定性、再現性を確認中である。