両生類および魚類における脳内概日時計の所在とその機能の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11640686
• Research Institution: Sophia University
• Principal Investigator: 千葉 篤彦 上智大学, 理工学部, 助教授 (40207288)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 飯郷 雅之 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (10232109)
• Keywords: 両生類 / 概日リズム / 脳内概日時計 / 位相反応曲線 / 時計遺伝子 / メラトニン / メラトニン受容体 / 細胞外記録

Research Abstract

両生類の概日リズムに関する知見は少ない.本研究では両生類の脳内概日時計の所在の検索をイモリを用いて試みた。両生類の概日リズムに関する基礎的なデータを含め、得られた知見と経過を報告する。
1.まず行動リズムについて恒暗下で1時間の光パルスに対する位相反応曲線(PRC)を作成した。得られたPRCは1型で、主観的夜前半の位相後退相は主観的夜後半の前進相より大きかった。現在、最大の位相の前進及び後退が見られるCT15及びCT21に光パルスを与えcFos、phospho-CREB、phospho-p44/42 MAP kinaseが発現する部位を免疫組織化学的に調べているが、位相変位と相関のある陽性反応は得られていない。
2.時計遺伝子ClockのcDNAクローニングを縮重プライマーを用いたPCRにより試みているが、ClockをコードするcDNA断片はまだ得られていない。
3.内因性のメラトニンの概日時計への関与を検討する為の基礎データとして、眼、松果体および血中のメラトニン濃度をRIAで測定した結果、三者ともにメラトニン濃度は夜間に高く昼間に低かった。また、眼、松果体の摘出実験により血中メラトニンは眼と松果体の双方に由来することが示唆された。メラトニンの作用部位を明らかにするためにin vitroオートラジオグラフィーによりメラトニン受容体の脳内分布を検討したところ、メラトニン受容体は視床下部、視蓋などに広く分布していることが判明した。
4.マルチチャンネル細胞外記録システムを用いてイモリ脳のスライスからMultiple Unit Activity(MUA)の長期記録をするためorganotypic slice culture系を確立した。コラーゲンtype Iをコートした培養皿を用い、80%Leibovitz′s L-15+5〜7%ウシ胎児血清の培養液中(週に一度交換)で、厚さ250μmの脳スライスは20℃で2週間以上生存することが分かった。MUAの記録を現在試みている。