ホメオボックス遺伝子を用いた色素上皮細胞からの網膜神経細胞の分化誘導とその移植

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11671736
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 高橋 政代 京都大学, 医学研究科, 助手 (80252443)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柏井 聡 京都大学, 医学研究科, 助手 (50194717) ; 田辺 晶代 京都大学, 医学研究科, 助手 (80243020)
• Keywords: 色素上皮細胞 / 塩基性線維芽細胞成長因子 / 上皮細胞成長因子 / ホメオボックス遺伝子 / Rax / Crx / CHX10 / アデノウィルスベクター

Research Abstract

(虹彩色素上皮細胞の培養)
生後1〜3日のニワトリの眼球摘出後、前眼部を分離し虹彩組織を切開により回収した。ディスパーゼおよびEDTA処理後、虹彩色素上皮細胞のみを分離し、コラーゲンコートした培養皿上で血清添加培地を用いて培養すると色素を有する虹彩色素上皮細胞が得られた。この培養細胞を塩基性線維芽細胞成長因子および上皮細胞成長因子を添加した無血清培地で培養すると、虹彩色素上皮細胞は急速に色素を失い増殖を続ける未分化な細胞が得られた。
(網膜特異的ホメオボックス遺伝子のアデノウィルスベクターへの組み込み)
網膜特異的なホメオボックス遺伝子であるRax、Crx、CHX10を組み込んだプラスミドを入手し、大腸菌を用いて増幅させた。制限酵素で切り出したそれぞれのホメオボックス遺伝子をコスミドベクターに組み込み、相同的遺伝子組換えを用いて、それぞれのホメオボックス遺伝子を発現するアデノウィルスベクターを作成した。これらのアデノウィルスをそれぞれ293細胞に感染させて増殖させ、塩化セシウムのステップグラジエント法によってそれぞれのホメオボックス遺伝子を発現するアデノウィルスを精製した。
(アデノウィルスベクターによる神経系幹細胞への遺伝子導入)
アデノウィルスベクターによる神経系幹細胞への遺伝子導入の有効性を調べるため、レポーター遺伝子であるGFP(Green Fluorescein Protein)遺伝子を組み込んだアデノウィルスを用いて海馬由来神経系幹細胞への遺伝子導入実験を行った。このウィルス感染によりGFP遺伝子が導入された細胞は蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を発する。このアデノウィルスを感染させることにより神経系幹細胞はほぼすべての細胞において緑色蛍光を発し、効率よく遺伝子導入されることが示された。

Research Products

• [Publications] Takahashi M 他: "Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-mediated gene transfer"J.Virol.. 73. 7812-7816 (1999)
• [Publications] Nishida A 他: "Differentiation of the transplanted adult hippocampus-derived stem in adult rat retina with mechanical injury"Invest Opthalmol Vis Sci (suppl.). 40S. 598-598 (1999)
• [Publications] Kurimoto Y 他: "Transplantation of neural stem cells into the retina injured by transient ischemia"Invest Opthalmol Vis Sci (suppl.). 40S. 727-727 (1999)
• [Publications] Haruta M 他: "Retinal transplantation of the isolated progenitor cells from embryonic rat retina"Invest Opthalmol Vis Sci (suppl.). 40S. 728-728 (1999)
• [Publications] Takahashi M: "Tissue engineering for therapeutic use Vol.3.Ed. Yoshito Ikada"Elsvier Science. 10 (1999)