フィブロネクチン分子の細菌体結合エピトープの構造解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11671873
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 伊藤 博夫 鹿児島大学, 歯学部, 助教授 (40213079)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 五月女 さき子 鹿児島大学, 歯学部, 助手 (20325799) ; 北田 勝浩 鹿児島大学, 歯学部, 助手 (90195264)
• Keywords: フィブロネクチン / 細胞外基質タンパク質 / 感染性心内膜炎 / モノクローナル抗体 / エピトープ・マッピング / ビリダンスレンサ球菌 / 口腔細菌

Research Abstract

フィブロネクチン(Fn)は病原性微生物の組織定着の標的分子として重要視されている。心内膜炎原因菌のひとつGranulicatella (Abiotrophia) adiacensの固相化したヒトFnへの付着能を阻害する抗Fnモノクローナル抗体(mAb)を樹立し、その対応エピトープがFn分子の中央領域の120kDaの、これまでに細菌との結合が知られていない領域に局在し、さらに本mAbはG.adiacens以外の細菌種のFn付着を阻害するという結果を受け、エピトープのモチーフの同定 Fn分子上の標的エピトープ領域の絞り込みを試みた。1粒のビーズ状固相担体に1種類のペプチドが固定化された合計約6000万種のランダム・ヘキサペプチドライブラリーから、mAbに認識されるペプチドをスクリーニングし、選別された個々のビーズのエドマン分解によるシーケンス分析を行ったが配列は同定されなかった。そこで強酸処理によりペプチドを担体から解離させ、質量分析による解析を試みたが、担体に由来するポリエチレングリコールスペーサーの妨害のため配列は決定できなかった。そこで、選別後の分析が確実なものとなるよう新たに設計したライブラリーを準備し、エピトープモチーフの同定を試みたところ、Met-Pro-Ginが候補配列として示唆された。Fnのキモトリプシンで消化で得られた標的エピトープを含む120kDaの領域を、精製後さらに、リジルエンドペプチダーゼで消化し、ウェスタンブロットならびに免疫沈降法によりmAb反応性を追跡することによって、標的エピトープ領域を含む領域を33kDaサイズまで絞り込んだ。また、完全長Fn分子に対する本mAbの反応は、精製した断片によって完全に阻害できたことから、本mAbのエピトープはこの断片中にのみ存在することが確認された。