2000 Fiscal Year Annual Research Report
ウシラクトペルオキシダーゼとその組み換え体を用いた構造と機能の解析
| Project/Area Number |
11694189
|
|---|
| Research Institution | HOKKAIDO UNIVERSITY |
|---|
Principal Investigator |
島崎 敬一 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (10091547)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田仲 哲也 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (00322842)
玖村 朗人 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (00241365)
中村 信吾 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (50003570)
|
|---|
| Keywords | ラクトペルオキシダーゼ / ヘム結合 / 抗菌活性 / 組換え体 / ミルクタンパク質 / 二次講造 |
|---|
| Research Abstract |
牛乳に含まれる酸化還元酵素・ラクトペルオキシダーゼの示す抗菌・抗ウイルス活性を自由に操作出来るならば、医薬品や食品へ応用する際に非常な利点となると考えられる。そこで組換えラクトペルオキシダーゼを調製し、牛乳由来のラクトペルオキシダーゼと比較することで、活性に寄与する高次構造、およびヘム近傍の微細構造についての詳細な情報を得ることを目的としてこれまでに以下の実験を行った。
○ラクトペルオキシダーゼの検出に用いる目的で、ラクトペルオキシダーゼに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成した。モノクローナル抗体については、ラクトペルオキシダーゼ分子内のエピトープ部位も決定した。
○ウシ乳腺細胞からラクトペルオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、CHO細胞を用いて組換え体を発現させ、さらにイオン交換クロマトグラフィーにて精製した。発現した組換え体の確認は、抗ラクトペルオキシダーゼ抗体および活性測定にて行った。
本年度はこれまでに作製した組換えラクトペルオキシダーゼを用いて以下の結果を得た。
○円偏光二色性スペクトルの測定により、牛乳ラクトペルオキシダーゼと高次構造が同じであることを確かめた。一方、牛乳ラクトペルオキシダーゼのN-末端アミノ酸部分は組換え体に比べて15〜20残基短かいことを見いだし、ミルク中に分泌される際の機構に新たな知見を加えた。
○牛乳から分離したラクトペルオキシダーゼおよび組換えラクトペルオキシダーゼをペプシン分解した後、ヘム結合フラグメントを逆相クロマトグラフィーにより分離することに成功した。現在、そのフラグメントのアミノ酸配列を決定中であり、ヘムとの結合様式を推定する手掛かりとなるものと期待される。
|
