1999 Fiscal Year Annual Research Report

瞬間凍結・マイクロダイセクション法を用いた一細胞からの遺伝子単離への挑戦

Research Project

Project/Area Number	11876027
Research Institution	Kyoto Prefectural University
Principal Investigator	増村威宏京都府立大学, 農学部, 講師 (50254321)
Keywords	瞬間凍結 / マイクロダイセクション / 遺伝子単離 / イネ / 登熟期種子 / cDNAライブラリー / 組織分化 / 遺伝子発現
Research Abstract	植物ゲノム解析研究分野において、機能遺伝子の迅速な単離方法の開発は益々その重要性が増大している。そこで、研究代表者がこれまでに培った遺伝子単離技術を活用し、遺伝子発現が進行中の細胞領域をマイクロダイセクション法で取得後、cDNAライブラリーを作製し、特定の組織でのみ発現する機能遺伝子の取得を目標とした。今年度は、cDNAライブラリー作製の為に必要な基盤技術の確立を行った。研究対象は登熟期のイネ胚乳組織とした。イネゲノム解析の基準品種である日本晴と、栽培期間が短く個体数確保が容易な矮性イネ(豊雪矮性)を実験材料に選定した。開花後2,3,4日目の種子の形態観察を行い、内胚乳とアリューロン層への分化開始時期を詳細に調査した。組織観察と生化学的な解析の結果、分化開始時期は開花後3日目と考えられた。そこで、開花後3日目の種子を瞬間凍結し、コンパウンドで固定後切片化し、レーザーメスにより目的部分の組織をマイクロダイセクションした。精密に分離した微量組織を出発材料にmRNAを調整し、逆転写反応を行い、組織特異的cDNAを合成した。既に取得している開花後3日目に特異的に発現する2種類のcDNAクローンの塩基配列データに基づき、PCR用プライマーを設計し、逆転写反応後のcDNAを鋳型とし、cDNA断片の増幅を試みた。切断分離した数個の細胞からなる微量組織を出発材料に用いた場合でも、特定のcDNA断片を増幅できたことから、数細胞レベルでのcDNAライブラリー作製には、何ら問題が無いことが判った。今後は、出発細胞数を更に微量化し、ベクターおよび形質転換技術を高め、最終的には一細胞由来のcDNAライブラリーを作製し、細胞特異的に発現する遺伝子の候補を集める予定である。

Research Products
(4 results)

All Other

All Publications (4 results)

[Publications] 上中弘典他5名: "Molecular cloning and characterization of a cDNA for an iron-superoxide dismutase in rice(Oryza sativa L.)"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(2). 302-308 (1999)
[Publications] 光川典宏他5名: "Amino acid sequencing and cDNA cloning of rice seed storage proteins, the 13kDa prolamins, extracted from type I protein bodies"Plant Biotechnology. 16(2). 103-113 (1999)
[Publications] 森田重人他3名: "Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress; the involvement of hydrogen peroxide in oxidative stress signaling"Plant Cell Physiology. 40(4). 417-422 (1999)
[Publications] 光川典宏他4名: "Molecular cloning and characterization of a Cystein-rich 16.6-kDa prolamin in rice seeds"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(11). 1851-1858 (1999)

1999 Fiscal Year Annual Research Report

瞬間凍結・マイクロダイセクション法を用いた一細胞からの遺伝子単離への挑戦

Principal Investigator

増村 威宏 京都府立大学, 農学部, 講師 (50254321)

Research Products

[Publications] 上中弘典 他5名: "Molecular cloning and characterization of a cDNA for an iron-superoxide dismutase in rice(Oryza sativa L.)"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(2). 302-308 (1999)

[Publications] 光川典宏 他5名: "Amino acid sequencing and cDNA cloning of rice seed storage proteins, the 13kDa prolamins, extracted from type I protein bodies"Plant Biotechnology. 16(2). 103-113 (1999)

[Publications] 森田重人 他3名: "Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress; the involvement of hydrogen peroxide in oxidative stress signaling"Plant Cell Physiology. 40(4). 417-422 (1999)

[Publications] 光川典宏 他4名: "Molecular cloning and characterization of a Cystein-rich 16.6-kDa prolamin in rice seeds"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(11). 1851-1858 (1999)

増村威宏京都府立大学, 農学部, 講師 (50254321)

[Publications] 上中弘典他5名: "Molecular cloning and characterization of a cDNA for an iron-superoxide dismutase in rice(Oryza sativa L.)"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(2). 302-308 (1999)

[Publications] 光川典宏他5名: "Amino acid sequencing and cDNA cloning of rice seed storage proteins, the 13kDa prolamins, extracted from type I protein bodies"Plant Biotechnology. 16(2). 103-113 (1999)

[Publications] 森田重人他3名: "Induction of rice cytosolic ascorbate peroxidase mRNA by oxidative stress; the involvement of hydrogen peroxide in oxidative stress signaling"Plant Cell Physiology. 40(4). 417-422 (1999)

[Publications] 光川典宏他4名: "Molecular cloning and characterization of a Cystein-rich 16.6-kDa prolamin in rice seeds"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 63(11). 1851-1858 (1999)