1999 Fiscal Year Annual Research Report
DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発
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11878091
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石垣 靖人 金沢大学, 薬学部, 助手 (20232275)
二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
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| Keywords | DNA損傷 / モノクローナル抗体 / キャピラリー電気泳動 / ヌクレオチド除去修復 / 紫外線 |
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| Research Abstract |
1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製
当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。
2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発
本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^<TM>488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Ohtoshi,E.: "Respective roles of cyclobutane pyrimidine dimers, (6-4)photoproducts and minor photoproducts in UV mutagenesis of repair deficient xeroderma pigmentosum A cells."Cancer Res.. (in press). (2000)
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[Publications] Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab frangment of a monoclonal anitibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucleic Acids Res.. 28(4). 944-951 (2000)
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[Publications] Harada,Y.-N: "Postnatal growth failure, short life span, and early onset of cellular senescence and subsequent immortalization in mice lacking the xeroderma pigmentosum group G gene."Mol.Cell.Biol.. 19(3). 2366-2372 (1999)
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[Publications] Ishigaki,Y.: "Development and characterization of a DNA solar dosimeter."J.Photochem.Photobiol.B. 50(2-3). 184-188 (1999)
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[Publications] Kobayashi,H.: "Probing the interaction between a high-affinity single-chain Fv and a pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis."Biochemistry. 38(2). 532-539 (1999)
