キャッサバの遺伝子組換えによるキャッサバモザイク病耐性植物の作出

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11F01081
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 三位 正洋 千葉大学, 大学院・園芸学研究科, 教授
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): NTUI ValentineOtang 千葉大学, 大学院・園芸学研究科, 外国人特別研究員
• Keywords: バイオマス / 組織培養 / 遺伝子組換え / ウイルス耐性 / 植物体再生 / エネルギー作物 / 外被タンパク質 / Agrobcterium

Research Abstract

本研究はキャッサバの重要病害であるキャッサバモザイクウイルスに抵抗性をもった系統を、RNA干渉を利用した遺伝子組換えによって作出しようとするものである。得られた成果は以下の通りである。
(1)キャッサバモザイクウイルスのRNAから得た外被タンパク質遺伝子の短い断片を含むRNAiベクターの構築:スリランカ・キャッサバモザイクウイルスの外被タンパク質遺伝子から得た527bp断片をGateway entry vectorのpCR8-TOPOにクローニングし、配列解析、分析を行った後、eLR clonase^<TM> recombination reactionによってpEKH21N2ベクターに移し、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子および外被タンパク質断片のセンス、アンチセンス方向の配列をもったベクターを構築した。このベクターをtriparental matingによってAgrobacterium tumefaciens EHA105系統に導入し、EHA105pEKH2IN2CasMW系統を得た。
(2)RNAiコンストラクトのキャッサバ細胞への導入と植物体再生:キャッサバの実用品種KU50およびモデル系統TMS60444の腋芽を培養し、体細胞胚を経由した3ヶ月以内で養殖物が得られる迅速かつ単純な植物体再生系を開発した。ついで、これらのカルスにEHA105pEKH2IN2CasMVを導入し、カナマイシン選抜下で発根した植物体を得た。
(3)形質転換の確認:カナマイシン存在下で発根した個体の中から任意に選んだ数個体について、PCRによりnptIIの存在を確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度の研究開始時期が遅かったことによる研究の遅れの影響はほとんどなく、今年度予定した内容についてはほぼ完了し、次年度に向けての準備ができている。

Strategy for Future Research Activity

PCRによって形質転換の確認された個体において、さらに外被タンパク質遺伝子の導入と発現などに関する分析をPCR,サザン、ノーザン分析などを用いて行い、外被タンパク質遺伝子の導入が確認できた個体について順次耐病性に関するバイオアッセイを行っていく予定である。