2012 Fiscal Year Annual Research Report
BRG1によるクロマチン構造変化を介した細胞初期化促進メカニズムの解明
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11F01388
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山中 伸弥 京都大学, iPS細胞研究所, 教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
KIM Shin-Il 京都大学, iPS細胞研究所, 外国人特別研究員
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| Keywords | Induced Pluripotent Stem Cell(iPSC) / Reprogramming / Chromatin Remodeling / Epigenetic Modification / Embryonic Stem Cell(ESC) / Regenerative Medicine |
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| Research Abstract |
分化した体細胞に4種類の転写因子Oct4, Sox2, Klf4, cMycを強制発現させることで、すべての体細胞に分化しうるiPS細胞を樹立することができる。しかしながら、iPS細胞樹立のメカニズムについては不明な点が多い。iPS細胞の樹立過程では、遺伝子配列の変化を必要としない一方で、DNAメチル化やピストン修飾などエピゲノム修飾の大きな改変を伴う遺伝子発現変化が観察される。クロマチンリモデリング酵素の一つであるBRG1はES細胞の多能性維持に重要であることが示され、BRG1を介したクロマチン構造変化が多能性幹細胞の維持およびその樹立に関与していることが示唆されている。そこで、我々は、BRG1が体細胞初期化に関与する可能性を考え、薬剤誘導可能な初期化因子を導入した細胞を用いて、iPS細胞誘導の様々な段階でのBRG1の役割の解析を行なった。本研究課題の目的は、クロマチンリモデリング因子と初期化因子の関連性を明らかにすることである。初年度の目標は、薬剤誘導による体細胞初期化システムの特徴を調べることであった。本研究の基本となるデータを得るため、いくつかのアッセイ系を確立し、薬剤誘導後の時間経過にしたがって変化する様々な現象について解析した。その結果、多くの遺伝子が体細胞初期化過程で変化するが、BRG1の発現レベルは、初期化過程を通して一定のままであることを明らかにした。現在、タンパク質レベルでの制御機構に焦点を当て解析を行なっている。特に、体細胞初期化過程でBrg1と相互作用する因子を同定し、効率の良いiPS細胞誘導法の確立やクロマチン制御機構の解明につなげたいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ドキシサイクリンによる誘導後の細胞の形態変化を観察、解析した。初期化因子(Oct4,Sox2,Klf4,cMyc)を発現する繊維芽細胞をFACS解析により同定し、それらの性質を調べた。さらに、初期化因子(Oct4,Sox2,Klf4,cMyc)のタンパク質レベルでの発現量をウェスタンブロッティングで調べた。結果、それぞれのタンパク質の発現量の違いが細胞形態と密接に関連していることを明らかにした。iPS細胞誘導過程の細胞表面マーカーとして知られるThy1,SSEA1及びEPCAMを用いてFACS解析を行い、リプログラミング過程の細胞集団の割合の変化を調べた。リプログラミング過程のグローバルな遺伝子発現の変動はマイクロアレイによって解析し、qRT-PCRによって確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
BRG1非存在下でのiPs誘導の分子機構を調べるため、RNAiによって内在性BRG1の遺伝子発現を抑制する。2)BRG1の遺伝子発現抑制後の遺伝子発現の変化を調べるため、経時的にサンプルを採取し、マイクロアレイ解析を行う。3)ChlPシーケンスによってOct4,Sox2,Klf4及びcMycのターゲット遺伝子のプロモーター領域への結合を調べる。
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