異なる細胞外環境下でのRhoファミリー活性可視化から迫る生体内細胞集団移動の機構

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11J40006
• Research Institution: Kyoto University
• Research Fellow: 青木 玲奈 (伊藤 玲奈) 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(RPD)
• Keywords: 低分子量Gタンパク質 / FRET / ショウジョウバエ / イメージング

Research Abstract

生体内FRETイメージングの定量的な比較解析により細胞集団移動の多様性を明らかにする。直接比較可能なFRETの定量的データを取得し、それらを細胞形態と外環境因子のパラメータで分類し、異なる細胞集団の移動モードの解明を目指す。また、生体内FRETイメージング技術は未だ発展途上で、改良が必要とされている。特に、分子プローブの発現量を上げ、微弱な蛍光と槌色を抑えた経時観察、および、5次元(x,y,z,t,マルチカラー)の大容量画像をいかに効率よく扱うかが、本研究の肝となる。
1.定量的データ測定方法の確立
共焦点レーザー顕微鏡によるショウジョウバエのFRETイメージングの技術を確立する。解析に十分な蛍光量と槌色の抑制を両立するために、ヒストブラスト経時観察においては15分以上の撮影間隔が必要なことが分かった。この撮影間隔は遺伝子型や撮影条件によって変動するが、個々のヒストブラスト細胞の特定と追跡を難しくさせる。そのため、赤色蛍光蛋白質で標識された蛋白質を共発現させて、FRET撮影休止間の細胞の動きを観察できる系統を樹立した。細胞の追跡と、細胞内低分子量G蛋白質の活性化状態を同時に取得可能な系が構築できた。
2.生体内イメージングに最適化させるためのFRET(RhoA)プローブの改良
FRETプローブの発現量を上げるため、プラスミドベクターpJFRCへの改良とコドンの最適化を行った。しかしながら、培養細胞(ショウジョウバエS2細胞)での発現量は顕著に上昇したが、作製したトランスジェニックショウジョウバエは観察に十分な発現量が得られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画に沿った実験を終了させて、研究成果が出ているため。

Strategy for Future Research Activity

効率的な画像データ解析を行うために細胞追跡プログラムを作製して、画一的に多量の画像データを解析できる系を構築していく予定である。このプログラムを使用して、変異体や過剰発現、RNAiを連携させた定量的データの網羅的解析を進める。ただし、細胞集団内に一部変異体細胞を作製しても、細胞集団全体に影響は出にくい可能性がある。アクチン骨格系などの赤色蛍光蛋白質で標識できる系統を用いて、集団の一部の変異体細胞の影響を調べる解析方法の構築と、細胞集団全体を変異体にする系の構築を行う。
FRETプローブの改良に関しては、これまで使用してきたFRETプローブの発現量を上げることができなかったので、今後は別のグループから報告されているFRETプローブを導入することを試みる。