構造及び機能単位としてのモジュールを組み合わせた新規蛋白質の分子設計と創製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12002008
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 森島 績 京都大学, 工学研究科, 教授 (50026093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 若杉 桂輔 京都大学, 工学研究科, 助手 (20322167) ; 高橋 聡 京都大学, 工学研究科, 助手 (30283641) ; 石森 浩一郎 京都大学, 工学研究科, 助教授 (20192487)
• Keywords: 蛋白質工学 / 生物物理学 / 生体分子 / 酵素 / 生物物理化学 / 分子設計

Research Abstract

1.モジュール間相互作用の再生を目指した方法論の開発
ヘモグロビンα鎖のヘム結合モジュールを、シトクロムb_5の対応する領域に導入したb_5αb_5を作製し、ランダム変異導入後、ヘム親和性を指標に構造が安定化している蛋白質のスクリーニングを行ったところ、ヘム結合モジュールに近接する特定の部位に変異が集中していた。そこで、今回、構造上の歪みがかかっていると考えられるこれら残基に範囲をしぼってランダム変異を導入した変異体集団を作製し、同様なスクリーニングを行った。その結果、ヘムの親和性が大きく向上した蛋白質を得ることに成功した。現在、スクリーニング過程に、崩れた構造の変異蛋白質を蛋白質分解酵素により除去するプロセスを新たに加え、方法論の改良を行っている。
2.シトクロムP450の電子供与蛋白質に対する認識特異性の変換
バクテリア由来P450cam、真核生物由来P450には、それぞれ特異的な電子供与蛋白質が存在する。今回、真核生物P450の電子伝達蛋白質との結合モジュールをP450camに導入したモジュール置換蛋白質を作製し、認識特性の変換を試みた。この蛋白質は、天然のP450camと同様の活性型のヘム近傍構造を維持していることが各種分光測定の結果、明らかになった。現在、認識特性について解析を行っている。
3.シグナルカスケードを制御可能な人工グロビン蛋白質の設計
アミノアシルtRNA合成酵素(TrpRS)と結合するデヒドロゲナーゼ(GapDH)のモジュールをミオグロビン(Mb)と融合することにより、TrpRSとの結合を制御する蛋白質の創製を試みた。このキメラ蛋白質は、天然のMb同様、酸素が可逆的に配位できる安定なヘム近傍構造を持つ一方、天然のGapDH同様、TrpRSと特異的に結合でき、さらに、TrpRSのアミノアシル活性を上昇できることが明らかになった。
さらに、脳内グロビン蛋白質Ngbがシグナルを制御するセンサー蛋白質であることを発見した。この構造及び機能解析の知見をもとに人工的なセンサー蛋白質の創製にも挑んでいる。

Research Products

• [Publications] Yoshioka, S. et al.: "Roles of the proximal hydrogen bonding network in cytochrome P450cam-catalyzed oxygenation"J. Am. Chem. Soc.. 124. 14571-14579 (2002)
• [Publications] Tosha, T. et al.: "Molecular mechanism of the electron transfer reaction in cytochrome P450cam-putidaredoxin : roles of glutamine 360 at the heme proximal site"Biochemistry. 41. 13883-13893 (2002)