2000 Fiscal Year Annual Research Report
脳神経内分泌小胞膜貫通電子伝達系の構築原理と生理機能
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12050236
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| Research Institution | Himeji Institute of Technology |
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Principal Investigator |
鍔木 基成 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (00145046)
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| Keywords | クロマフィン小胞 / ノルアドレナリン / チトクロム b561 / アスコルビン酸 / 電子伝達 / ビタミン C / 膜タンパク質 / MALDI-TOF-MS |
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| Research Abstract |
(1)酸化型チトクロムb561をDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理すると、AsAからの電子伝達が阻害され、ヘムの還元速度が顕著に低下し、しかも約半分のヘムしか還元されない。パルスラジオリシス法によりMDAとの反応を調べると、還元型ヘムの酸化過程は未処理の場合と同程度であったが、続くAsAによるヘムの再還元過程は全く観察されなかった。DEPCによる修飾部位をtrypsin,V8 protease消化断片のMALDI-TOF-MSスペクトルにより解析した結果、His88,His161,Lys85の3つの残基が修飾されていることがわかった。
(2)チトクロムb561をDEPCで処理する際にAsAを添加しておくと、カルベトキシ化による電子伝達反応の阻害から保護されることがわかった。MALDI-TOF-MSスペクトルによる解析の結果、細胞質側ヘムの配位子His88,His161の修飾が阻害され、その結果AsAからの電子受容能が保護されたと考えられる。以上の結果は、チトクロムb561中の2つのヘムは、AsAとMDAとの電子伝達反応において別個の役割を持ち、MDAは小胞内側に位置するヘムを酸化し、その後、細胞質側に位置するヘムからの分子内電子伝達反応が起こると、酸化された細胞質側ヘムが再びAsAにより還元されると思われる。さらに細胞質側ヘムの近傍にAsA結合部位が存在することを示している。
(3)下等な中枢神経系を持つプラナリア(扁形動物門)におけるチトクロムb561の全長のcDNAクローンを得ることに成功した。アミノ酸配列解析により、高等動物で完全に保存されて、機能的に重要な役割を持っていると思われる2つの保存性領域が、プラナリアb561においても完全に保存されていることが明らかとなった。高等動物において完全保存されていた6つのHis残基の内の1つが、Asn残基に置換していることがわかった。この結果、細胞質側のヘムの配位子が特定できた。さらにC末端部位に対する抗体及びcDNAによるin situ hybridizationによりチトクロムb561が神経系特異的に発現していることを明らかにした。
(4)植物)にもチトクロムb561に類似したタンパク質が発現している。このb561類似タンパク質構造・機能・生理的役割を明らかにするため、A.thalianaに加えてトウモロコシのcDNAライブラリーからの遺伝子クローニングを行った。根に発現するタイプと思われるb561の部分配列を決定し、さらにC末端部位に対する抗体を作製するための発現ベクターの構築を行った。
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[Publications] Tsubaki,M.: "Diethylpyrocarbonate-modification abolishes fast electron accepting ability of cytochrome b561 from ascorbate but does not influence on electron donation to monodehydroascorbate radical"Biochemistry. 39. 3276-3284 (2000)
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[Publications] Uchida,T.: "Active Site Structure of SoxB-type cytochrome bo^3 oxidase from thermophilic Bacillus"J.Inorg.Biochem.. 82. 65-72 (2000)
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[Publications] Tsubaki,M.: "Probing Molecular Structure of dioxygen reduction site of bacterial quirol oxidase through ligand binding to the redox metal centers"J.Inorg.Biochem.. 82. 19-25 (2000)
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[Publications] Neya,S.: "Unusual spin state eqilibrium of azide metmyoglobin induced by core deformed heme."Inorg.Chem.. (in press). (2001)
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[Publications] Takeuchi,F.: "Ascorbate inhibits the carbethoxylations of two histydyl and one tyrosyl residues indispensable for the membrane electron transfer"Biochemistry. (in press). (2001)
