2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12215086
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
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| Keywords | EGF / EGF受容体 / GFP / Grb2 / Ras / Raf1 / SH_2ドメイン / リン酸化 |
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| Research Abstract |
本研究は、上皮成長因子(EGF)により活性化される細胞増殖のための細胞内情報伝達網の働きを、細胞内で1分子計測し、解析することにより、増殖信号の伝達機構を解明することを目的とする。
細胞における1分子測定は、これまでに報告がなかった。最近、我々は細胞の細胞表面でEGF分子の1分子可視化に成功し、EGF受容体の局在と運動、さらに分子間相互作用を細胞内で1分子測定することが可能になった。これらの1分子測定法をさらに発展させることにより、研究を進めている。
本年度はEGFの情報伝達素過程の細胞内1分子追跡法の開発をおこなった。その結果、EGFの活性化を認識する抗体や、各種緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質などを用いて、以下の情報伝達素過程を細胞内で1分子追跡することができるようになった。
(1)EGF受容体の自己リン酸化反応の1分子可視化
自己リン酸化により構造変化したEGF受容体を特異的に認識する抗体を蛍光標識し、EGF受容体に結合した蛍光EGFと2色同時観察することによる。
(2)EGF受容体とアダプター蛋白質の相互作用の1分子可視化
EGF受容体を認識するアダプターGrb2タンパク質のSH2ドメインを大腸菌で発現・精製し蛍光標識した。
(3)Ras,Raf-1の細胞内1分子可視化
GFP変異体のひとつYFPとの融合タンパク質として細胞内に発現させたRas,Raf1を生きている細胞内で1分子可視化し、その運動を追跡することができるようになった。
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Research Products
(3 results)
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[Publications] Y.Sako,S.Minoguchi & T.Yanagida: "Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells"Nature Cell Biology. 2. 168-172 (2000)
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[Publications] Y.Sako,K.Hibino,T.Miyauchi,Y.Miyamoto,M.Ueda & T.Yanagida: "Single-Molecule lmaging of Signaling Molecules in Living Cells"Single Molecules. 1. 159-163 (2000)
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[Publications] F.Kano,Y.Sako,M.Tagaya,T.Yanagida & M.Murata: "Reconstitution of brefeldin A-induced Golgi-tubulation and its fusion with the ER in semi-intact CHO cells"Mol.Biol.Cell.. 11. 3073-3087 (2000)
