2001 Fiscal Year Annual Research Report
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12490018
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| Research Institution | KYOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
林 隆久 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (70231529)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉山 淳司 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (40183842)
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| Keywords | セルロース合成 / GhCesA2 / AxCesA1 / 昆虫培養細胞 / 結晶化 |
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| Research Abstract |
ワタのセルロース合成酵素遺伝子GhCesA2の全長(Full length cDNA)をバキュロウィルスによって昆虫培養細胞で発現させ、リコンビナントタンパク質の大量生産を試みた。昆虫培養細胞では、GhCesA2は成育を阻害することなく発現され、大量生産が可能となった。昆虫細胞で発現された遺伝子産物を1% Triton X-100によって可溶化し、ゲル濾過及びショ糖密度勾配超遠心法によってその分子量を測定した。その結果、セルロース合成酵素(GhCesA2)は、ホモダイマー構造を取ることが明らかとなった。このことは、セロビオース単位でセルロースが合成されることを示している。
合成酵素の結晶化にむけた大量発現系の確立を試みた。セルロース合成酵素は膜タンパク質であり、精製および結晶化が困難であるため、その三次構造は解明されていない。本研究ではセルロース合成菌セルロース合成酵素触媒サブユニット(AxCesA1)にHisタグを付加したリコンビナントタンパク質を昆虫細胞に発現させた。現段階ではタンパク質の発現をSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングにより確認したのみであるが、このリコンビナントタンパク質を大量発現させ、付加したHisタグを利用して精製できる見通しを得た。近いうちに、このタンパク質について活性を測れる場合はそれを指標に、活性が簡単には測れないがある程度の大きさがる場合は電顕観察あるいはX線小角散乱により測定できる段階になった。
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[Publications] Y.Ihara, F.Sakai, T.Hayashi: "Transferase activity of GhCesA2 (putative cotton cellulose 4-β-glucosyltransferase) expressed in Pichia pastoris"J. Wood Sci.. (印刷中).
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[Publications] T.Konishi, T.Nakai, F.Sasaki, T.Hayashi: "Formation of callose form sucrose in cotton fiber microsomal membranes"J. Wood Sci.. 46. 1-7 (2001)
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[Publications] T.Konishi, F.Sakai, T.Hayashi: "Functional analysis of cellulose-synthase-like genes"International Congress Series. 449. 75-78 (2001)
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[Publications] Y.Ohmiya, Y.W.Park, T.Hayashi: "Cellulose metabolism in poplar"the Proceedings of Workshop : Interaction between Cell Wall Components. 11-12 (2001)
