2000 Fiscal Year Annual Research Report
リボザイムによる蛋白キナーゼアイソザイム発現抑制とヒスタミンH_1受容体機能調節
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12557231
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
福井 裕行 徳島大学, 薬学部, 教授 (90112052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多比良 和誠 東京大学, 大学院・工学研究科, 教授 (10261778)
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| Keywords | リボザイム / ヒスタミンH_1受容体 / 蛋白キナーゼC / 受容体脱感作 / アップレギュレーション / アイソザイム |
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| Research Abstract |
ヒスタミンH_1受容体の機能は細胞外のヒスタミンの情報を細胞内に伝達することである.しかし,H_1受容体自身が情報伝達の調節機構に深く関与することが明らかにされつつある.その機構のひとつはH_1受容体蛋白のリン酸化による脱感作機構であり,もうひとつはH_1受容体遺伝子発現による受容体up-調節機構である.双方ともに蛋白キナーゼC(PKC)が関与していることが強く示唆される.ところが,PKCには種々のアイソザイムが存在し,これらの機構を深く調べるためにはアイソザイムを特異的にノックアウトできるアイソザイム特異的リボザイムを用いることが有効であると考えられる.また,リボザイムは種々の蛋白発現をノックアウトするためにもたいへん有効な手段である.今年度までに以下の研究成果をあげ,さらに進展させようとしている.
1.PKCアイソザイムのうち,PKC-αに対するリボザイムの設計をおこなった.
PKC-αの塩基配列の5′側に近い部分から5カ所選択し,それぞれに対応するリボザイムをコードするRibo-PKC-α1〜Ribo-PKCα5までを作成した.
2.リボザイムをコードするcDNAを挿入するベクターの改変:
pcDNA3.1Zeo+のプロモーターであるCMVを制限酵素,Nrul,SnaBIで切断,除去し,さらに,閉還させ,pcDNA3.1Zeo+CMV(-)を作成した.
3.リボザイムをコードするcDNAのうち,先ず,Ribo-PKC-α1をpcDNA3.1Zeo+CMV(-)に挿入し,プラズミドpcDNA3.1Zeo+CMV(-)-PKC-α1を作成した.
4.現在,作成したプラズミド,pcDNA3.1Zeo+CMV(-)-PKC-α1をヒスタミンH_1受容体発現細胞株であるヒト由来HeLa細胞,および,ヒト由来アストロサイトーマU373細胞にトランジエント,および,恒久的発現を試みている.
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