リボザイムによる蛋白キナーゼアイソザイム発現抑制とヒスタミンH_1受容体機能調節

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12557231
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 福井 裕行 徳島大学, 薬学部, 教授 (90112052)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 多比良 和誠 東京大学, 大学院・工学研究科, 教授 (10261778)
• Keywords: リボザイム / ヒスタミンH_1受容体 / 蛋白キナーゼC / 受容体脱感作 / 受容体アップ調節 / アイソザイム / cGMP依存性蛋白キナーゼ

Research Abstract

ヒスタミンH_1受容体は細胞外情報のヒスタミンを認識して細胞内に情報伝達を行うのみならず,受容体自身が情報伝達の調節機構に積極的に関与することを明らかにしつつある.その機構のひとつはヒスタミンH_1受容体蛋白のリン酸化による脱感作機構であり,もうひとつはH_1受容体遺伝子転写活性上昇よる受容体up-調節機構である.双方ともに蛋白キナーゼC (PKC)が関与する.そこで,これらの機能に関与するPKCアイソザイムを同定するために個々のアイソザイム特異的リボザイムを作成している.1.PKC-αの塩基配列の5'側に近い部分から選択した5カ所のリボザイムインサート,Ribo-PKC-α1〜Ribo-PKCα5を作成し,pcDNA3.1 Zeo+CMV(-)に挿入し,プラズミドpcDNA3.1 Zeo+CMV(-)-PKC-α1〜pcDNA3.1 Zeo+CMV(-)-PKC-α5を作成した.2.作成したプラズミドをヒスタミンH_1受容体発現細胞株であるHeLa細胞,U373細胞,リコンビナントH_1受容体発現CHO細胞にトランジエント,および,恒久的発現を試みた.3.恒久的発現は細胞が死ぬ傾向が見られた.トランジェント発現におけるプラズミドの導入効率は40〜50%であり,その条件ではPKC発現レベルの低下はウェスタンブロット解析で観察できなかった.そこで,1.導入効率のよいリポゾームを用いてリボザイムの高発現を試みる.2.画像解析を用いてリボザイムの発現した細胞についてPKC発現の消失を確かめる.そして,目的を達成する.一方,ヒスタミン誘発H_1受容体ダウン調節に対してGキナーゼ阻害薬が強力に作用することを見いだした.Gキナーゼアイソザイム特異的リボザイムによるアイソザイムの同定を行う.

Research Products

• [Publications] S.Horio, H Fukui: "Inhibition of oxotremorine-induced desensitization of guinea-pig ileal longitudinal muscle in Ca^<2+>-free conditions"J. Pharmacy Pharmacol.. 53. 249-254 (2001)
• [Publications] 金山幸治: "ヒスタミンH_1受容体量とシグナル伝達の相関性およびプロテインキナーゼCによる受容体up-regulation"Therapeutic Research. 22. 19-24 (2001)
• [Publications] 福井裕行: "神経ペプチドとヒスタミンH_1受容体"アレルギー科. 12. 365-371 (2001)
• [Publications] H.Kashiba: "Histamine H_1 receptor mRNA is expressed in capsaicin-insensitive sensory neurons with neuropeptide Y-immunoreactivity in guinea pigs"Brain Res.. 901. 85-93 (2001)
• [Publications] Ogawa, M.: "Histamine Research in the New Millennium"Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. 4 (2001)