合成ヘムとミオグロビン変異体による亜硝酸還元酵素モデルの構築と反応機構の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12640549
• Research Institution: Cente for Integrative Biosience
• Principal Investigator: 藤井 浩 岡崎国立共同研究機構, 総合バイオサイエンスセンター, 助教授 (80228957)
• Keywords: 亜硝酸還元酵素 / ヘム / 一酸化窒素 / 反応機構 / 人工酵素 / ミューテーション

Research Abstract

昨年度に合成したジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体をミオグロビンに再構成を試みた。ミオグロビンのヘムを分離してアポミオグロビンとした後、ジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体のアルカリ溶液を添加した、カラムにより精製を行ったところ、合成したジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体が再構成されることがわかった。再構成されたミオグロビンは、本来のミオグロビンとは異なり、むしろ目的とする亜硝酸還元酵素の分光学的性質と類似していた。そこで、さらに触媒活性をもたせるため、ミオグロビンの変異体の作成を行った。亜硝酸還元酵素の活性中心と類似の構造をとるようにするため、ミオグロビンのヒスチジン-64をチロシンに変異させた。さらに、触媒活性をあげるため、ロイシン-29とフェニルアラニン-45をそれぞれヒスチジンに変異させた。3重ミュータントを大腸菌で発現させたところ、十分な発現量の変異型ミオグロビンを単離することができた。さらに、これをアポ化したのち、ジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体と複合体を生成させた。カラム分離後、種々の分光学的性質を測定した結果、今回の変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体は亜硝酸還元酵素の分光学的性質とよい一致を示した。これは、変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体が、亜硝酸還元酵素のモデル酵素になることを示し、当初の目的の一つを達成すことができた。さらに、このモデル酵素に亜硝酸イオンを添加したところ、鉄3価の活性中心に配位することがわかった。これは、酵素反応が鉄2価を軽油して進行するというこれまでの提案とは異なる結果を示し、鉄3価での反応機構の可能性を示唆した。