微量複製型二本鎖RNAの改変RAPD法による未知ウイルス遺伝子のクローニング

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660041
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 夏秋 知英 宇都宮大学, 農学部, 教授 (10134264)
• Keywords: 難純化RNAウイルス / 複製型二本鎖RNA / PCR / Cryptovirus / キュウリ黄化ウイルス / カンキツトリステザウイルス

Research Abstract

作物のウイルス病では迅速・簡便・正確・安価・安全に病原ウイルスを検出同定し,防除方法を確立することが肝要であるが,いまだに一部のウイルスRNAウイルスでは純化が困難なために抗血清の作製はおろか塩基配列の情報もないような状態である。そこで本研究では難純化RNAウイルスの塩基配列を簡易に解析する方法を確立することを目的とし、まずその増殖過程で生ずる複製型二本鎖RNAに着目した。二本鎖RNAは健全植物にはほとんど含まれていない。種子伝染性潜伏ウイルス(Cryptovirus)由来の二本鎖RNAが健全植物から検出されこともあるが、これはRNAウイルス由来の複製型二本鎖RNAとは容易に区別できる。しかし、このような複製型二本鎖RNAを精製してクローニングするには多大な労力が必要である。そこで各種RNAウイルスについて,簡便なPCR法で二本鎖RNAを増幅できないか検討し、今年度は次のような結果を得た。(1)Cryptovirusではすりつぶした感染葉汁液をPCRチューブに入れ,その後チューブを軽く洗浄してからcDNA合成とPCRを行っても容易にそのゲノム二本鎖RNAを増幅できることが判明した。なおこの方法は他のRNAウイルスにも適用可能であった。(2)キュウリ黄化ウイルスでは複製型二本鎖RNAを用いてゲノムRNAのほぼ全長をクローニングすることに成功し,現在シーケンス中である。このウイルスの全塩基配列は世界中で未報告である。(3)カンキツトリステザウイルスにおいても2分離株のゲノムRNA全長を決定し、そのうちの1分離株については論文を発表した。

Research Products

• [Publications] Suastika,G.,Natsuaki,T.,Terui,H.,Kano,T.,Ieki,H.and Okuda,S.: "Nucleotide sequence of citrus tristeza virus seedling yellows isolate"Journal of General Plant Pathology. 67(1). 73-77 (2001)