体細胞変異選抜した青枯病抵抗性トマトにおける抵抗性変異誘発機構の分子生物学的解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660050
• Research Institution: KINKI UNIVERSITY
• Principal Investigator: 豊田 秀吉 近畿大学, 農学部, 教授 (00150805)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野々村 照雄 近畿大学, 農学部, 講師 (30319660) ; 松田 克礼 近畿大学, 農学部, 助教授 (30268453)
• Keywords: レトロトランスポゾン / トマト / 遺伝子発現検出 / マイクロマニピュレーション / トリコーム / RT-PCR

Research Abstract

平成15年度には、トマトに存在するレトロトランスポゾンの検索とその発現解析を試みた。まず、トマトから染色体DNAを抽出し、ゲノムライブラリーを作製した後、レトロトランスポゾン内に存在する逆転写酵素の保存領域をプローブとしてスグリーニングを行なった。その結果、複数のクローンが得られたので、それらの塩基配列を決定し、遺伝子発現検出(RT-PCR)に使用するプライマーを構築した。次に、トマトの根、茎、葉および培養細胞から全RNAを抽出し、RT-PCRを行なったところ、すべての組織から増幅産物が得られた。一般的にレトロトランスポゾンはストレスなどの刺激または細胞培養の過程で活性化されると考えられるので、通常状態で検出される原因を調査した。その結果、DNAが染色体を鋳型として増幅されていることが判明した。PCRは極微量の染色体DNAが混在しても、それを鋳型として反応が起こり、正確な遺伝子発現を検討する際の妨げとなる。報告者らは、オオムギ子葉鞘の単細胞を標的として、細胞内RT-PCRを行ない、遺伝子発現を検出するシステムを確立している。本法は顕微鏡下で特定細胞から細胞内容物(mRNA)を吸引する手法であり、細胞内に核を残存させることが可能であることから、本法を適用すれば、梁色体DNAの混在を回避できると考えた。そこで、本法をトマトに適用するため、標的に適した組織・細胞を検討したところ、単細胞で構成されている根毛およびトライコームが最適であることが明らかになり、新しい遺伝子発現検出システムが確立された。

Research Products

• [Publications] Takeshi Sameshima et al.: "Cytological events in tomato leaves inoculated with conidia of Blumeriagraminis f sp hordei and Oidium neolycopersici KTP-01"Journal of General Plant Pathology. 70. 7-10 (2004)
• [Publications] Koichi Kashinoto et al.: "Infectivity of a Japanese isolate of Oidium neolycopersici KTP-01 to a European tomato cultivar resistant to O.neolycopersici"Journal of General Plant Pathology. 69. 406-408 (2003)
• [Publications] Wataru Oichi et al.: "Cosecutive monitoring for conidiogenesis by Oidium neolycopersici on tomato leaves with a high-fidelity digital microscope"Journal of General Plant Pathology. (in press). (2004)
• [Publications] Mizuki Wada et al.: "Possible amplification of mature mRNAs in single cells of tomato callus aggregates by direct RT-PCR of cytosolic contents suctioned out with a micropipette"Plant Cell Tissue and Organ Culture. (in press). (2004)
• [Publications] Kazuhisa Fujita et al.: "Powdery mildew pathogens can suppress the chitinase gene expression induced in detached inner epidermis of barley coleoptile"Plant Cell Reports. (in press). (2004)
• [Publications] Yoshinori Matsuda et al.: "Molecular Discrimination of Different Powdery Mildew Fungi Simultaneously Attacking Plant Leaves by the Phylogenetic Analysis of rDNA Internal Transcribed Spacer Sequences Amplified from Their Individual Propagules by Normal and Nested PCRs"Phytopathology. (in press). (2004)
• [Publications] Yoshinori Matsuda et al.: "Direct RT-PCR amplification of mature mRNAs in single trichome cells of plant leaves"Recent Research Developments in Cell Biology. (in press). (2004)