β-アミラーゼのドメイン工学

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660077
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 三上 文三 京都大学, 農学研究科, 助教授 (40135611)
• Keywords: β-アミラーゼ / X線結晶構造解析 / 至適pH / デンプン吸着ドメイン / タンパク質工学

Research Abstract

産業的により優れた機能を持つβ_アミラーゼを開発するために、本酵素の至適pHおよびデンプン粒分解活性についての機能解析をX線結晶構造解析に基づいて行い、変異酵素の設計とそのX線結晶構造解析を行った。
【1.触媒部位周辺残基の系統的変異によるβ-アミラーゼの至適pHの変更】
ダイズβ-アミラーゼの触媒残基のひとつであるGlu380の側鎖と水素結合を形成する3個の残基の微生物型への改変により至摘pHがそれぞれアルカリ側に移行したことから、逆にBacillus cereusのβ-アミラーゼの対応する残基をダイズ型に変異した結果、至適pHがやはり酸性側に1pHユニット以上移行することを認めた。しかし、その原因がGlu380の側鎖との水素結合の有無によるのか、周辺の静電的環境によるのか不明であった。そこで、Bacillus cereusの酵素のTyr164のGlu164およびGln164への変異を行った結果、両者とも至適pHが酸性側に移行し、静電的環境変化よりも触媒残基との水素結合の有無が重要であることが示唆された。また、Bacillus cereusの酵素の3個の残基の植物型への変異の導入はダイズ酵素の対応する変異に比べて環境変化が大きく、Thr328のAsn328への変異によって、ダイズ酵素のGlu380に対応するGlu367の側鎖が約1Å移動し、このことにより比活性が約8%まで低下することがX線結晶構造解析の結果明らかになった。
【2.微生物β-アミラーゼのデンプン粒分解活性の強化】
Bacillus cereusのβ-アミラーゼのC末端に存在するデンプン吸着ドメインについて、グルコアミラーゼのデンプン吸着ドメインとの比較から2個存在するデンプン吸着サイトのうち2番目のサイトに欠陥があると考えられたので、その修復変異を試みたが、その部分が触媒ドメインとの接触領域にあるため、大腸菌での発現率が極端に低下した。そこで、進化工学的手法を導入し、得られた酵素の機能解析と構造解析を行うこととし、現在、変異酵素のスクリーニング系の確立を行っている。

Research Products

• [Publications] E.Sarikaya, B.Mikami: "Purification and crystallization of alpha-amylase from mucoid and non-mucoid B. Amyloliquefaciens strains"J.Crystal Growth. 232. 418-420 (2001)
• [Publications] H.-J.Yoon et al.: "Crystal structure of alginate lyase A1-III complexed with trisaccharide product at 2.0A"J. Mol. Biol.. 307. 9-16 (2001)