鉄型ニトリルヒドラターゼ活性化蛋白質の構造機能相関の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660093
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 遠藤 勲 理化学研究所, 生化学システム研究室, 主任研究員 (00087470)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105) ; 尾高 雅文 理化学研究所, 生化学システム研究室, 研究員 (20224248)
• Keywords: システイン酸化体 / 非ヘム鉄タンパク質 / 金属タンパク質特異的シャペロン / 翻訳後修飾 / システインスルフィン酸 / システインスルフェン酸

Research Abstract

鉄型ニトリルヒドラターゼ(NHase)は活性中心である非ヘム鉄センターにシステイン酸化体を配位子として有することが明らかにされた唯一の蛋白質である。この修飾の触媒反応に対する機能および生成機構はまたく解っていない。申請者らはNHase遺伝子下流に存在するORFがこの酵素の組換え体発現に必須であることを見出した。この結果は、このORF産物はニトリルヒドラターゼ特異的な金属シャペロン様分子として働くNHase活性化蛋白質であることを示唆している。本研究課題では、NHase活性化蛋白質の機能を明らかにし、NHaseにおける新規な活性中心形成機構を明らかにすることを研究目的とする。本年度は以下の研究を行った。
(1)NHase活性化蛋白質抗体の作製-これまでのところシークエンスデータベース中でNHase活性化蛋白質に高い相同性を持つ蛋白質は見つかっていない。従って、この蛋白質はNHase特異的に作用しているユニークな蛋白質である可能性が高い。NHase活性化蛋白質のポリクローナル抗体作製を目的として、同蛋白質の精製を行った。NHase活性化蛋白質遺伝子をT7プロモータ下流にサブクローニングし、大腸菌に形質導入し、37度にて発現させたところ、封入体として発現した。封入体を単離後、6M尿素にて可溶化し、6M尿素存在下でのSuperQトヨパールおよびResourceQカラムクロマトグラフィーを行い、SDS-PAGEで単一のバンドとなるまでに精製することに成功した。
(2)NHase活性化蛋白質とNHaseαサブユニットの相互作用解析-NHaseにおける金属配位子は全てαサブユニット上にあるので、NHaseはαサブユニットと相互作用する可能性が高い。αサブユニットのN末端にHisタグを導入した組換え体をNHase活性化蛋白質と大腸菌で共発現させ、Ni-Hisタグアフィニティクロマトグラフィーによって精製したところ、NHase活性化蛋白質は多くが素通り画分に溶出したが、αサブユニット同じ位置にも溶出した。SDS-PAGEのバンド強度からこの画分には1:20程度のモル比(NHase活性化蛋白質:NHase)でNHase活性化蛋白質が含まれていることが解った。すなわち、αサブユニットの一部がNHase活性化蛋白質と複合体を形成しているものを予想される。現在、イオン交換、疎水相互作用、ゲル濾過HPLCを用いてこの複合体の単離を試みている。

Research Products

• [Publications] Endo,Isao: "What evidences were elucidated about photoreactive nitrile hydratase?"Journal Molecular Catalysis B : Enzymatic. 10. 81-86 (2000)
• [Publications] Piersma,Sander R.: "Arginine 56 mutation in beta subunit of nitrile hydratase : importance of hydrogen bonding to the non-heme iron center"Journal of Inorganic Biochemistry. 155. 283-288 (2000)
• [Publications] Isao,Endo: "Fe-type nitrile hydratase"Journal of Inorganic Biochemistry. (in press). (2001)