Bacillus sp.由来ウリカーゼ反応機構に関する構造生物学的研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660099
• Research Institution: Fukui Prefectural University
• Principal Investigator: 日び 隆雄 福井県立大学, 生物資源学部, 講師 (00285181)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 宏 関西学院大学, 理学部, 専任講師 (10252719) ; 小田 順一 福井県立大学, 生物資源学研究科, 教授 (50027041)
• Keywords: 尿酸 / ウリカーゼ / X線結晶解析 / 酸素ラジカル / 酸化還元酵素

Research Abstract

一重項状態である尿酸を基質として三重項ラジカルである酸素を用いた酸化反応を触媒するにもかかわらずウリカーゼ(UOX)は補酵素を有しておらず、その反応機構については不明な点が多い。本研究は、原核生物Bacillus sp.由来UOXを用いて本酵素の3次元構造を明らかにし、その反応機構を解明しようとするものである。本年度は、リガンドフリーのnative酵素とinhibitor複合体の結晶を得ることを目的として実験を行った。
まずHanging Drop蒸気拡散法によるUOX結晶化条件の検討を行った。酵素溶液初期条件:酵素濃度10mg/ml,6% PEG8000,0.08M Li_2SO_4,0.5mM 8-azaxanthine,0.1M Tris-HCl,pH8.5、結晶化母液初期条件:12% PEG8000,0.16M Li_2SO_4,0.1M Tris-HCl,pH 8.5とし20℃で結晶化を行った。その結果、0.5×0.3×0.03μmの板状結晶を得た。Spring-8のビームラインBL41XUにおいてX線回折測定が行われた結果、分解能42.6-2.8Åの範囲で収集されたデータの統計解析の結果はcompleteness 99.6%,redundancy 7.4,R_<merge>=0.107であり、結晶学的データとして空間群P21212、格子定数a=78.85Å,b=133.69Å,c=144.58Å,α=β=γ=90°を得た。またリガンドフリーでの結晶化については、酵素濃度10mg/mlの時に結晶化母液初期条件:25% PEG8000,0.15M(NH_3)_2SO_4,0.1M cacodylate-NaOH,pH6.5とし20℃で結晶化を行い、0.6×0.3×0.02μmの板状結晶を得た。回折測定に関しては現在検討中である。