魚病細菌に対する赤血球膜糖タンパク質グリコホリンの生体防御機能の研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660184
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 青木 恭彦 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (00212366)
• Keywords: 魚類 / 血液 / 赤血球膜 / 糖タンパク質 / グリコホリン / O-グリコシド型糖鎖 / シアル酸 / NGNA

Research Abstract

健全なコイの背部動脈から血液をシリンジを用いて採取し、直ちに白血球および血漿を遠心分離によって分離した後、得られた赤血球から赤血球膜の調製を行った。得られた赤血球膜は冷凍保存し、ある程度集めた赤血球膜標品を凍結乾燥した後、LIS-フェノール法を用いてコイのグリコホリンを抽出した。SDS-PAGEで純度の検定したところ、脂質がほとんど混在しないシアル酸を含む糖タンパク質が検出された。このコイグリコホリンを用いてβ-脱離を行ってシアル酸含有糖鎖を遊離させ、遊離したシアル酸含有糖鎖のみを調製した。陰イオン交換型HPLCを用いてNaClで濃度勾配法を行い、糖鎖を溶出させたところ、全ての遊離糖鎖はモノシアリルオリゴ糖とジシアリルオリゴ糖の2種類に分離できた。クロロホルム-メタノールによる抽出による糖脂質の抽出を行ったが、ヒトと比較して少量であり、かつシアル酸は含まれていなかった。コイグリコホリンを用いた種々のレクチン反応および薄層クロマトグラフィーを用いて検討した結果、含有糖鎖中にはNGNA(N-グリコリルノイラミン酸)とN-アセチルガラクトサミン、フコース、ガラクトースおよびグルコースであることが示唆された。そこで、糖に特異的な電気化学検出器を用いた糖分析用HPLCシステム(申請物件)を用いて検討したところ、上記の糖が高感度で検出され、コイグリコホリンの糖組成を確認した。
コイグリコホリンを、魚病の病原菌を含む種々の細菌(Aeromonas hydrophila,Edwardsiella tarda, Vibrio anguillarum, Bacillus subtilisおよびMicrococcuss luteusを使用)に作用させたところ、凝集反応は観察されなかったものの、電子顕微鏡による観察ではコントロールとの差異が確認された。